[发明专利]一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术

摘要

本发明涉及双酶共表达技术及双酶偶联与固定化技术，具体涉及一种定点突变葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达制备方法以及该双酶的偶联与固定化技术以及偶联固定双酶在红枣浓缩汁生产阿洛酮糖中的应用。为解决高热量糖给人们造成的健康问题，本发明提供了一种以红枣浓缩汁中D-葡萄糖、D-果糖作为底物，采用多酶偶联及固定化技术将重组酶葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶共固定化后双酶偶联促进生产低热量D-阿洛酮糖的方法；同时提供了对葡萄糖异构酶146位氨基酸定点突变，并与D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的方法。

主权项

一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于按照以下步骤进行：第一步，获得目的基因将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸，然后将突变后的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶核苷酸序列分别进行PCR扩增；将扩增后的所述定点突变的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶核苷酸序列分别纯化后，分别克隆所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶核苷酸序列；第二步，重组表达质粒的构建将上述得到的定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列及pCDFDuet‑1载体分别用Bam HI和Kpn I进行双酶切，将D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet‑1载体分别用Bgl II和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T₄连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，链霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序；产物再将阳性转化子的质粒转入宿主菌中诱导表达得到重组菌；第三步，将重组菌经离心收集，并超声破碎，再次离心即得到定点突变的葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶共表达的粗酶液；第四步，固定化将得到的粗酶液加入树脂中，每1.0g树脂加酶量：0.5~2ml基因重组制备的粗酶液，吸附温度为25℃~35℃，吸附pH=6.5~7.5，吸附时间100~140min，然后加入交联剂，交联25~35min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.03%~0.06%；第五步，催化红枣汁生产阿洛酮糖将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度：60~70℃；pH值：5.0~7.0；所述红枣汁与固定化酶的重量份比为1~5:1；5~10小时候完成催化反应，得到D‑阿洛酮糖混合液。