[发明专利]一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法

摘要

本发明公开了一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的NOS3基因、FASLG基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供精子细胞凋亡相关基因检测，并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。

主权项

1.一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，其特征在于，具体步骤为步骤1：检测的样品类型与采样方法用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2：基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3：荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即一氧化氮合酶(NOS3)rs1799983，TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG)rs763110，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl10X荧光定量PCR反应缓冲液ABITaqman®MGB、0.1μl25mMdNTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl25mMMgCl₂溶液、0.02μl（5units/μl）TaqDNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测，其引物探针如下：带VIC荧光A型探针TGAgCCCCCAGAA带FAM荧光G型探针TGAtCCCCCAGAA正向引物CTCCCCACAGCTCTGCAT反向引物CAGTCAATCCCTTTGGTGCT带VIC荧光C型探针TTGcGAAATACAA带FAM荧光G型探针TTGtGAAATACAA正向引物GATAGCACCACTGCACTCCA反向引物TCATCTCTTCCCCACACACA将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到一氧化氮合酶(NOS3)rs1799983，TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG)rs763110两张图；步骤4：SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；（1）、一氧化氮合酶(NOS3)rs1799983在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，（2）、TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG)rs763110在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型。