[发明专利]一种用于近缘物种鉴别的PCR引物设计方法

摘要

本发明公开一种用于近缘物种鉴别的PCR引物设计方法。本发明方法包括：获得目标种系和非目标种系同一基因的多条DNA序列，并进行多序列比对，获得多序列比对文件；按照常规引物设计方法设计出多个上游引物和下游引物，并排除敏感性和特异性低于设定阈值的单向引物；剩余的上游引物和下游引物互相配对，产生引物对，排除不合理的及敏感性和特异性较低的引物对；计算剩余各引物对的P值，进行聚类分析，取出每类中P值最小的引物对作为设计得到的PCR引物。本发明提供的用于近缘物种鉴别的PCR引物设计方法，能快速设计出对目标种系具有高度特异性且敏感性高的PCR引物，降低了种系特异性PCR引物设计的难度。

主权项

一种用于近缘物种鉴别的PCR引物设计方法，其特征在于，方法包括以下步骤：1）获得近缘物种中，目标种系和非目标种系同一基因的序列，并进行多序列比对，获得多序列比对文件；2）以步骤1）中获得的目标种系基因序列之一作为模板序列，确定模板序列中的高度保守区；3）以步骤2）中作为模板序列的目标种系基因序列，排除步骤2）中确定的高度保守区，按照常规引物设计方法，设计出多个上游引物和多个下游引物，然后，计算各引物的敏感性和特异性，排除敏感性和特异性低于设定的敏感性阈值和特异性阈值的上游引物和下游引物； 4）将剩余的上游引物和下游引物互相配对，产生引物对；然后，① 排除产物大小为负或产物长度范围不在200‑2000bp的引物对；② 计算各引物对的敏感性和特异性，排除敏感性和特异性低于设定的敏感性阈值和特异性阈值的引物对；③ 排除不能通过常规引物设计软件检验的引物对；5）计算步骤4）中获得的剩余引物对中每个引物对的P值，计算公式为：P=(C!×D!×(A+B)!×(C+D‑A‑B)!)/(A!×B!×(C‑A)!×(D‑B)!×(C+D)!)；其中，A=引物能匹配的目标种系基因序列的个数；B=引物能匹配的非目标种系基因序列的个数；C=目标种系基因序列的总个数；D=非目标种系基因序列的总个数；然后对步骤4）中获得的剩余引物对中的每个引物对进行聚类分析，把与模板序列结合位置相差小于10个碱基的引物对聚为一类，最后取出每类中P值最小的引物对作为用于近缘物种鉴别的PCR引物。