[发明专利]电荷‑质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒

摘要

本发明属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及电荷‑质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。该电泳分离方法是基于酸性条件下Cu2+与蛋白质中氨基酸残基的选择性配位作用，使得蛋白质不仅由碱性氨基酸残基的质子化带上正电荷，而且还由金属离子的选择性配位作用使相似氨基酸序列组蛋白异构体带上不同的正电荷，施加直流电后，带不同正电荷的组蛋白异构体具有不同迁移速率，从而得以分离；一维电荷分离后，可进一步进行SDS‑PAEG凝胶电泳，利用电荷‑质量双聚焦二维凝胶电泳实现对组蛋白异构体的分离。本发明电泳分离方法操作过程简单，分辨率高，成本低，克服了现有技术中等电点聚焦电泳容易发生蛋白质沉淀以及对组蛋白异构体分析的局限性。

主权项

电荷‑质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)组蛋白生物样品预处理：配制样品质子化缓冲溶液，将组蛋白生物样品溶解于所述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液；再向质子化组蛋白生物样品溶液中加入CuSO4溶液，使Cu2+与组蛋白充分结合，得到组蛋白生物样品上样液；所述CuSO4溶液的浓度为40μg/μl，所述CuSO4溶液与质子化组蛋白生物样品溶液按照质量比为1～5：1的比例混合；所述样品质子化缓冲溶液的各组分配比为：尿素0.36g，冰醋酸50μl，0.2wt％派洛宁Y溶液60μl，加水定容至600μl；(2)第一维电荷电泳分离：制备吐温‑醋酸‑尿素浓缩胶和吐温‑醋酸‑尿素分离胶，采用常规电泳系统进行第一维电荷电泳分离，将步骤(1)得到的组蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条；所述吐温‑醋酸‑尿素浓缩胶的各组分配比为：含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250μl、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30μl和10wt％过硫酸铵140μl；所述吐温‑醋酸‑尿素分离胶的各组分配比为：尿素3.6g、含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μl、蒸馏水3.73ml、10vt％吐温370μl、四甲基二乙胺60μl和10wt％过硫酸铵280μl；(3)将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺分离胶上，加入指示剂，进行第二维SDS‑PAGE质量电泳分离，电泳结束后，得到电荷‑质量二维电泳分离凝胶胶条，所述电荷‑质量二维电泳分离凝胶胶条经染色和脱色后得到电荷‑质量二维电泳分离凝胶电泳图。