[发明专利]基于寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交探测的靶核酸序列的检测

摘要

本发明涉及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶核酸序列的检测。本发明利用基于形成靶-依赖性延伸二聚物的捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交抑制的发生。因此，本发明在杂交寡核苷酸未被切割的情况下也可检测靶序列。相关地，可以容易地设计5’-标记部位、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸序列，还可以容易地设定反应条件。并且，可在与捕捉和模板化寡核苷酸的延伸互不相同的容器中实施杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的检测。

主权项

一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸‑依赖性非‑杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’‑靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’‑标记部位，包含与上述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列，上述3’‑靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’‑标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位或5’‑标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位或5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位及3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板‑依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；步骤(e)，在存在包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸的情况下，在规定温度范围内，对上述步骤(d)的产物实施解链分析或杂交分析，上述靶核酸序列不存在于上述核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号，在上述靶核酸序列存在于上述核酸试样内的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供上述信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及步骤(f)，检测用于表示在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。