[发明专利]一种大量制备双功能域β‑折叠桶植酸酶二体的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种大量制备双功能域β‑折叠桶植酸酶（二体）的方法。根据本发明的方法，首先利用PCR反应从phyH基因中获得双功能域β‑折叠桶植酸酶基因，在大肠杆菌中的表达，变复性得到有活性的酶溶液，再分离纯化得到双功能域β‑折叠桶植酸酶二体，得到的二体酶活性和蛋白量都得到显著的提高。

主权项

一种大量制备双功能域β‑折叠桶植酸酶二体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在原核生物中表达氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的双功能域β‑折叠桶植酸酶，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中；(2)包涵体洗涤用洗涤缓冲液洗涤沉淀，用洗涤缓冲液1重新将沉淀悬起，匀浆充分后，离心弃去上清溶液，洗涤过程重复2遍，再用洗涤缓冲液2洗涤沉淀，其中，所述洗涤缓冲液1的配方为Tris‑HCl 50mmol/L、1mmol/L EDTA，1％TritonX‑100，pH为8.0，所述洗涤缓冲液2的配方为Tris‑HCl 50mmol/L、1mmol/L EDTA，pH为8.0；(3)包涵体的溶解将洗涤干净的沉淀溶于变性缓冲液中，所述变性液的配方为：8M尿素，50mmol/L Tris‑Cl，pH8.0，离心后弃去沉淀保留上清液，得到较纯净的包涵体溶液；(4)重组蛋白梯度透析复性将溶解在8M尿素中的包涵体溶液稀释为1mg/mL，先用复性缓冲液透析，时间为12个小时，透析期间要用搅拌子进行低速搅拌，再更换复性缓冲液，逐步降低使用的尿素含量：4mol/L，2mol/L，1mol/L,0mol/L，复性缓冲液中其他成分均不改变，得到了具有生物酶活性的蛋白溶液，其中所述复性缓冲液的配方为：50mmol/LTris‑HCl，6mol/L尿素，1mmol/L氯化钙，pH8.0；(5)步骤(4)获得的复性后的蛋白溶液经镍柱亲和柱层析分离，分子筛层析进一步分离纯化，镍柱预先用bufferA平衡，bufferA：20mmol/L Tris‑HC、1mmol/L氯化钙，pH8.0，将复性后的溶液缓慢上样，上完柱用bufferB平衡，bufferB：20mmol/L Tris‑HCl、1mmol/L氯化钙、20/L mmol咪唑，pH校准为8.0，洗杂蛋白，用bufferC洗脱目的蛋白，bufferC：20mmol/L Tris‑HCl、1mmol/L氯化钙、250mmol/L咪唑，pH校准为8.0，用30kDa截留量的浓缩管浓缩至0.5ml，以AKTApurifer系统进行凝胶过滤纯化，分子筛superdexG‑200预先用bufferD平衡，bufferD：20mmol/L Tris‑HCl、1mmol/L氯化钙，pH校准为8.0，得到了双功能域β‑折叠桶植酸酶二体溶液。