[发明专利]表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用，提供带有绿色荧光蛋白的真菌表达载体，该载体含有潮霉素B抗性基因hph和绿色荧光蛋白基因gfp，采用农杆菌介导法将该载体转化尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株race1，转化子能够表达绿色荧光蛋白，将转化菌株分别侵染嫁接砧木和西瓜的根，通过实时监测荧光菌株来准确分析尖孢镰刀菌西瓜专化型菌在植株根和下胚轴组织中的侵染情况。本发明具有快速简便且可以实时指示尖孢镰刀菌西瓜专化型菌侵染途径的特点，且本发明提供的方法适用于多种丝状真菌，可广泛应用于科研领域。

主权项

表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON‑GFP，其特征在于由以下步骤制备而得：（1）设计引物trpcp‑f和trpcp‑r，以pBARGPE1质粒为模板，扩增启动子trpC基因，获得了365bp的trpC条带，即为trpC基因，引物trpcp‑f、引物trpcp‑r和trpC基因序列分别如SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3；（2）采用Gateway克隆技术，通过BP和LR两步反应，将trpC基因置换到pMDC83载体中，PCR扩增获得一条1436bp的条带，即由启动子trpC启动的绿色荧光蛋白表达盒“trpC+GFP+nos”，将含有此表达盒的质粒命名为pWM10，“trpC+GFP+nos” 表达盒的序列如SEQ NO4；（3）再以pWM10质粒DNA为模板扩增“trpC+GFP+nos”基因，将扩增产物割胶回收后连接到pGEM‑T easy载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑筛选阳性克隆并提取大肠杆菌DH5α质粒；（4）将大肠杆菌DH5α质粒和pBC‑hygro载体质粒同时进行双酶切，利用T₄ DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，对阳性克隆分别进行PCR扩增和双酶切验证，然后测序鉴定，构建了表达载体pBC‑GFP；（5）采用农杆菌介导的遗传转化方法，将表达载体pBC‑GFP转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得了表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON‑GFP。