[发明专利]重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其应用

摘要

本发明涉及重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。获得重组野生型cC的方法是：利用pGAPZαA载体构建野生型cC的表达系统；重组野生型cC在毕赤酵母X-33中表达；重组野生型cC的分离纯化。对重组野生型cC对鲢鱼鱼糜凝胶劣化抑制作用的检测方法是：鱼糜样品的制作；对所取鱼糜样品进行温浴处理，加重组野生型cC和未加cC成为对照组；处理样品进行SDS-PAGE，观察结果。本发明验证了重组野生型cC可以直接加入鱼糜制品中，能明显抑制鱼糜制品的凝胶劣化，在加工过程中能较好的保持其弹性，且其安全、无毒，有着良好的应用前景。

主权项

重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于制备方法如下：1）获得野生型cC的cDNA，通过PCR的方法在cC的cDNA的两端添加XhoⅠ和XbaⅠ的切割位点序列；2）pGAPZαA‑cC重组质粒的构建：利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ同时处理野生型cC的 cDNA与pGAPZαA质粒载体，通过T₄ DNA连接酶将目的基因连接到载体上，获得含有cC目的基因的重组质粒pGAPZαA‑cC；3）pGAPZαA‑cC重组质粒的表达：将重组质粒pGAPZαA‑cC用AvrⅡ线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X‑33中，选取已经成功转化的菌落，在5mL YPD培养基中活化12h，再以1%的比例接入新的YPD培养基中30℃、200‑250rpm培养72h，得菌液；4）分离纯化：将菌液，首先3000×g，4℃，离心10min，除去菌体，留上清液，再11900×g，4℃，离心40min，除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScal TFF System浓缩至体积为50‑100ml，用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将其稀释到5倍体积后，样品通过CM‑Toyopearl 离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M‑0.5M的NaCl进行梯度洗脱，将收集的混合液经过夜透析除盐存于‑80℃冰箱，最后真空冷冻成粉末，得目标产物。