[发明专利]一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法

摘要

一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明应用购于北京军事医学科学院的重组金黄色葡萄球菌肠毒素D（SED）免疫8周龄BALB/c小鼠，经正常的免疫、细胞融合、筛选后得到10株SED单克隆抗体。10株抗体分别标记辣根过氧化物酶并进行两两配对。最后选定以5F2（CGMCC No.7212）、10F1（CGMCC No.7213）分别为包被抗体和酶标抗体，以SED为标准品建立了SED的双抗体夹心法。LOD为0.006ng/mL，线性范围0.02-2.5ng/mL。本发明采用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，与金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E无交叉反应，为食品中SED的检测提供了快速高效的分析手段。

主权项

一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，其特征在于：酶标板上包被了包被抗体5F2，即CGMCC No.7212，合适的浓度下可以最大限度捕获SED；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体10F1‑HRP，即CGMCC No.7213‑HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色15min；样品中SED浓度≥0.02ng/mL，那么样品中SED被包被抗体捕获并与酶标抗体10F1‑HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；样品中SED浓度＜0.02ng/mL，那么样品中SED不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性；（1）SED单克隆抗体的制备     以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株；（2）单克隆抗体的配对筛选将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度30ng/mL标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释800倍使用；在此条件下，实验成功得到了11对P/N值>10的配对；（3）夹心法的建立选择检测限最稳定的配对，即以5F2为包被抗体，以10F1作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：抗体包被浓度：1μg/mL，包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液，标品稀释液：0.01M、pH7.2 的PBS，检测抗体浓度：1μg/mL，反应时间：包被、封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色15min；优化后SED夹心法，LOD：0.006ng/mL，检测限0.02ng/mL。