[发明专利]一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法

摘要

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法。本发明以简单异尖线虫第三期幼虫总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增得到500bp大小的特异片段，将扩增产物克隆至pMD18-T转化感受态菌DH5-α,经酶切鉴定获得阳性重组质粒，然后将重组质粒和表达载体pET-32a分别以BamHI和HindШ双酶切后构建重组表达载体pET-32a-Ani-s4，并将其转化入大肠杆菌BL21中，提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后，用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测显示，融合蛋白的分子量约为25kDa，Ani s4基因在大肠杆菌中成功表达。同时所构建的表达蛋白具有的His-tag为其后的纯化工作提供了极大的便利。该ES抗原蛋白的成功表达，为后续的简单异尖线虫免疫学检测方法的研究奠定了基础。

主权项

一种简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于包括如下步骤：①简单异尖线虫总RNA的提取，②简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的RT‑PCR扩增，根据Ani s 4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamHI和Hind Ш酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下：上游引物5'—CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3' （SEQ ID NO.1），下游引物5'—CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA— 3' （SEQ ID NO.2），以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Ani s 4，③将纯化后的目的基因PCR产物和pMD18‑T载体进行连接，获得重组质粒pMD18‑T‑Ani‑s4；④原核表达载体的构建和鉴定：BamHI和Hind Ш双酶切质粒pMD18‑T‑Ani‑s4和质粒pET‑32a，回收所需目的片段，加入T4 DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌， BamH I和Hind Ш双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a‑Ani‑s4；⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至菌液的OD值为0.5‑0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L后34 ℃继续振荡培养进行诱导表达； 诱导表达后通过SDS‑PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达。