[发明专利]一种齐口裂腹鱼cGnRH Ⅱ基因克隆的方法

摘要

本发明涉及一种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法，具体包括以下步骤：(1)脑组织RNA的提取：总RNA提取采用TIANGEN试剂；(2)RACE扩增，具体包括：(2a)cDNA第一链合成；(2b)PCR扩增；(2c)RACE引物设计；(2d)5’-RACE；(2e)3’-RACE；(3)目的片段进行分离和回收；(4)感受态细胞制备；(5)连接和转化；(6)质粒DNA抽提。本发明技术提供了一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼chicken GnRHII基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了基础。

主权项

一种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)脑组织RNA的提取：总RNA提取采用TaKaRa试剂；(2)RACE扩增，具体包括：(2a)cDNA第一链合成：使用PrimerScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)逆转录试剂盒，具体步骤为：齐口裂腹鱼全脑总RNA1μg，50μmol/L Oligo(dT)引物1μL，5×M‑MLV buffer10μL，10mmol/L dNTP2.5μL，40U/μL RNase Inhibitor0.5μL，200U/μL RTase M‑MLV1μL；于42℃反应1h；反应结束后置于‑20℃保存；(2b)PCR扩增：采用Premier5和DNAMAN软件，根据GenBank中公布鲤科鱼类cGnRH II的保守序列的一致性，分布设计一对引物，在Bio‑Rad PCR扩增仪上进行，变性温度、退火温度和延伸温度根据引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR扩增得到部分cDNA片段序列予以测序；(2c)RACE引物设计：根据已获得cGnRH II保守序列分别设计设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1，3’上游特异性引物2；5’下游特异性引物1，5’下游特异性引物；(2d)5’‑RACE：按照试剂盒的操作流程进行，首先进行反转录反应，制备5′‑RACE‑Ready cDNA；(2e)3’‑RACE：3’RACE第一链cDNA合成反应50μL体系包括：齐口裂腹鱼全脑总RNA1μg，50μmol/L Oligo(dT)引物1μL，5×M‑MLV buffer10μL，10mmol/LdNTP2.5μL，40U/μL RNase Inhibitor0.5μL，200U/μL RTase M‑MLV1μL；于42℃反应1h；降落和巢式PCR方法体系同5’‑RACE；(3)目的片段进行分离和回收；(4)感受态细胞制备，具体步骤如下：用无菌铂丝直接醮取E.coli DH5α菌株，在LB平板表面划线，37℃倒置培养过夜；从LB平板上挑取单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；取30μL培养液接种于3mL LB液体培养基，37℃震荡培养2.5h，至肉眼能看到微微浑浊；将培养液转入1.5mL Eppendorf管，冰浴10min；4℃、4000r/min×5min，弃上清；用预冷的75mmol/L CaCl₂750μL轻轻悬浮细胞，冰浴30min；4℃、4000r/min×4min，弃上清；加入预冷的75mmol/L CaCl₂(内含甘油终浓度为15％)200μL，轻轻悬浮，冰浴至少4h，即成感受态细胞悬液，分装后‑80℃保存；(5)连接和转化：(5a)连接：在微离心管中依次加入PCR纯化产物4μL(约0.4μg)，载体pMD19‑T1μL，Solution I5μL；16℃水浴反应12h；(5b)转化：取200μL Top10感受态细胞悬液，加入连接溶液10μL，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入1mL37℃预热的液体培养基，37℃预表达1h，使细胞恢复正常生长状态；4℃，3500r/min×5min，将菌液浓缩至200μL，分别加入10μL的IPTG和X‑gal，轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含Amp⁺的LB固体培养基上，37℃正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养过夜；(6)质粒DNA抽提：挑取转化后的白色单菌落，分别接种于2mL含适当Amp+抗生素的LB培养基，37℃下225r/min振荡培养过夜，具体按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性克隆菌液大约500mL进行测序。