[发明专利]霉心病苹果中单端孢霉烯族毒素的提取纯化及测定方法

摘要

本发明公开了一种对霉心病苹果中T-2和NEO单端孢霉烯族毒素同时提取、纯化和检测的方法，以解决现有气相色谱和高效液相色谱检测中存在杂峰较多，受基质干扰严重的问题。该方法通过人工损伤接种苹果果实，使其产生霉心病，然后将霉心病组织粉碎后用甲醇/水振荡提取，然后对提取液进行纯化，再采用UPLC-MS/MS进行检测。本发明采用色谱结合质谱法具有高速、高效、高分辨、微量检测及分析自动化的性能和技术优势，可同时进行定性和定量检测，且检出限低、灵敏度高。采用的提取纯化方法使样品中的杂质相对较少，无需经常更换保护柱；采用UPLC-MS/MS对提取的样品检测，选择目标物质的离子碎片，避免了杂质峰的干扰，同时还省去了繁琐的衍生化步骤。

主权项

一种霉心病苹果中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于它包括以下步骤：A、样品预处理：选取外观整齐，无病虫危害的苹果果实，消毒，然后用无菌水冲洗，过夜晾干；然后在苹果果实上打3个接种内径为3mm的接种孔，立即向接种孔中接种粉红单端孢菌(Trichothecium roseum)的孢子悬浮液，被接种的苹果置于无菌塑料袋中20℃温度下孵育30d，接着切取苹果霉心病的病部组织，置于零下80℃的冰箱中冷藏待用；B、样品的提取：取出冷藏的霉心病病部组织，粉碎后称取5.0g于50mL的离心管中，加入25mL甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为80:20，漩涡均质3min，4℃温度下离心5min，离心机最大相对离心力为11000×g，上清液过滤转入150mL容量瓶中，下层沉淀用如上的方法重复提取两次，合并前3次的上清液于圆底烧瓶中，在60℃温度下旋转蒸发至近干，再用氮气流吹干，接着用4mL甲醇水溶液溶解，甲醇与水的体积比为80:20，经规格为4mL的priboFast M270的净化柱进一步纯化，将待纯化液体转入净化柱中，然后在30s之内迅速推下活塞，让溶液通过净化柱，得洗脱液；再将洗脱液减压旋转蒸发至近干，残留物通过氮气流吹干后复溶于1mL的流动相中，最后通过0.22微米的微孔滤膜，上机待测。