[发明专利]一种诱发花生毛状根的组织培养方法

摘要

本发明提供一种诱发花生毛状根的组织培养方法，属于植物组织培养领域。包括如下步骤：1）花生种子表面消毒和浸种；2）种子去掉种皮，保留含完全胚的一片子叶，接种到萌发培养基，光照培养7天；3）发根农杆菌的活化，挑空白或已转质粒的发根农杆菌（A.rhizogenes，K599）单克隆，在相应液体培养基中活化；4）用解剖刀将花生苗的根部完整切除，用注射器注射发根农杆菌至剩余下胚轴基部；5）转移至共培养培养基黑暗培养3天；6）转移至继代培养基20天，直至毛状根发出。通过本发明的方法，可在30天内得到花生毛状根，用于花生根部性状的转基因研究及次级代谢产物的生物合成。

主权项

一种诱发花生毛状根的组织培养方法，包括如下步骤：1）花生种子表面消毒和浸种，将花生去壳，75%乙醇中放置1分钟，弃乙醇，1%次氯酸钠中放置3分钟，随后用无菌水漂洗干净，放置无菌滤纸上晾干；2）取步骤 1）所述种子去掉种皮，保留含完全胚的单片子叶，接种到萌发培养基，30℃光照培养7天，所述萌发培养基为MS无机盐+质量比3%蔗糖+质量比0.8%琼脂粉；3）挑空白或已转质粒的发根农杆菌（A. rhizogenes）K599单克隆，在液体培养基中活化，条件为30℃，200rpm至OD600=0.6，所述液体培养基为LB 培养基+100mg/L利福平Rifampicin+100mg/L链霉素Streptomycin，已转质粒的农杆菌加入载体上抗性筛选基因所对应的抗生素；4）取步骤 2）所述诱发的花生幼苗，用解剖刀将花生苗的根部完整切除，用注射器多点注射发根农杆菌（A. rhizogenes）K599至剩余下胚轴基部；5）取经步骤 4）处理的花生苗，转移至共培养培养基黑暗培养3天，所述共培养培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+ 50μM乙酰丁香酮；6）取经步骤 5）处理的花生苗，转移至继代培养基，30℃光照培养20天，每5‑6天继代一次直至毛状根发出，所述继代培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉, 已转质粒的农杆菌加入载体上抗性筛选基因所对应的抗生素。