[发明专利]一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途

摘要

本发明公开了一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途，制备方法为：设计核糖体结合位点RBS1、RBS2、RBS3、RBS4和RBS5；将各个核糖体结合位点分别与基因ribA、ribB、ribD、ribE、ribC连接成片段，将各片段按顺序拼接并酶切连接到质粒pTrc99a得到质粒p20C-EC10；转入大肠杆菌，得到RF01S菌株；改造RF01S菌株的糖酵解途径及ED途径的相关基因，以提高核黄素的产量，并对核黄素的消耗途径进行改造，使核黄素代谢速度下降以进一步提高核黄素积累；将Ptrc强启动子插入到菌株的基因组中，得到生产核黄素的大肠杆菌菌株。本发明所构建的大肠杆菌菌株遗传背景清楚，可利用葡萄糖为底物生产核黄素，且在摇瓶发酵结果为1g/L以上，为提高核黄素产量和产率奠定了基础。

主权项

一种生产核黄素的大肠杆菌菌株构建方法，其特征是包括如下步骤：（1）设计以SEQ ID NO.37所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.38所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.39所示的核糖体结合位点RBS3、以SEQ ID NO.40所示的核糖体结合位点RBS4和以SEQ ID NO.41所示的核糖体结合位点RBS5；（2）分别将所述RBS1和基因ribA连接成片段1、将RBS2和基因ribB连接成片段2、将RBS3和基因ribD连接成片段3、将RBS4和基因ribE连接成片段4、将RBS5和基因ribC连接成片段5；（3）将步骤（2）所获得的片段1、片段2、片段3、片段4和片段5通过重叠‑延伸PCR依次连接并酶切连接到质粒pTrc99a得到质粒p20C‑EC10；转入大肠杆菌Escherichia coli MG1655，得到菌株命名为RF01S；（4）敲除步骤（3）所获得的菌株基因组的糖酵解途径中的pgi基因和ED途径中的edd基因及eda基因；对基因组的ribF基因上游+14到‑96之间的序列置换为由SEQ ID NO.42所示的J23115序列，得到由SEQ ID NO.43所示的ribF基因及改造后的上游序列，使核黄素代谢速度下降；（5）将Ptrc强启动子插入到步骤（4）所获菌株的基因组中acs基因上游55bp位点上，得到基因型为E.coli MG1655,ΔpgiΔedaΔedd P_J23115‑ribF P_trc‑acs;P_trc‑RBS1‑ribA‑RBS2‑ribB‑RBS3‑ribD‑RBS4‑ribE‑RBS5‑ribC,amp，命名为E.coli RF05S的生产核黄素的大肠杆菌菌株。