[发明专利]一种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法

摘要

一种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法，包括在体研究和离体研究，制作脑缺血缺氧大鼠模型，运用免疫荧光染色分别双标神经干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，利用激光捕获显微切割技术分别获取分化的神经细胞及未分化的神经干细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取各种细胞各组分的总蛋白质，通过Internet网进行搜寻已确定蛋白质的归属，运用生物信息学技术和MS-Fit软件方法，进行蛋白质鉴定和功能分析。

主权项

一种用功能蛋白质组技术研究HBO对NSCS分化调控的方法，包括在体研究和离体研究，所述在体研究包括以下步骤：1）脑缺血缺氧动物模型制作：除正常对照组、假手术组外，其余各组均造模，脑缺血缺氧模型采用经典Rice模型；2）高压氧处理：大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h内放入高压氧舱，压力为0.2MPa，舱内氧浓度为80%，每次1h，1次/d，连续7d；3）免疫荧光染色双标：取各组大鼠脑组织，用多聚甲醛固定，将脑冠固定后的脑组织进行常规脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片，分别加入一抗Brdu、Nestin、GFAP、Tuji、Galc，4℃过夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC标记的二抗，37℃温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况；4）采用激光捕获显微切割技术分别游离各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关蛋白的表达影响；所述离体研究包括以下步骤：1）神经干细胞培养：无菌条件下分离新生鼠脑组织，机械分成1mm³大小组织，加入培养液吹打成单细胞悬液，取少量细胞悬液接种于培养瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培养液，置于5%CO₂培养箱中，神经球形成后再次机械分离克隆制成单细胞悬液，将部分细胞悬液接种到新的培养瓶中培养，7d后机械分离克隆传代1次,方法同前，将培养的第3代神经干细胞制成单细胞悬液，分装在不同的25ml培养瓶中，分为正常对照组、模型对照组、高浓度氧组、高压空气组、高压氧组，1瓶/组；2）制造干细胞缺血缺氧模型：除正常对照组外，其余各组均造模，当培养的神经干细胞达80%的融合时换为新鲜的完全培养基，次日将培养基弃去代之以新鲜的无血清DMEM/F12培养基，并将细胞置于93%N₂，5%CO₂，2%O₂的培养箱37℃培养；神经干细胞在此环境中作用3h、6h、12h、24h，再Brdu共孵育48h后被用于相关实验；3）神经干细胞活力的测定从每组取1ml细胞悬液移入96孔酶标板,细胞密度为每孔103～104个细胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37℃孵育4h，终止培养，吸去培养上清液，每孔加入150ulDMSO，震荡10min使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值，4）高压氧下诱导神经干细胞分化：将上述高压氧组缺血缺氧细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板中，将一部分细胞于贴壁2h后进行Nestin免疫荧光染色；另一部分加入去除生长因子的血清DMEM/F12培养基继续培养7d，并同时将之置于高压氧环境下，压力为0.2MPa，每次1h，1次/d，连续7d。其余各组即是将各组同时至于各组环境下；5）神经细胞特异免疫荧光染色：将上述各组细胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分别加入一抗Brdu、Nestin、GFAP、Tuji、Galc，4℃过夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC标记的二抗，37℃温育2h，用免疫荧光显微镜观察神经干细胞的分化情况；6）应用流式细胞仪分别获取各组荧光标记的各种细胞，采用蛋白质顺序分级抽提法分别提取细胞各组分的总蛋白质，运用功能蛋白质组技术和生物信息学技术研究高压氧对神经干细胞分化相关的蛋白表达影响。