[发明专利]辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

摘要

本发明公开了一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：1）利用辣椒花药进行蛋白质的提取；2）第一向IPG等电聚焦电泳；3）胶条的平衡；4）胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶扫描和图像分析；从而得辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的辣椒花药蛋白质的双向电泳凝胶图谱，且实验结果稳定，此发明为进一步开展辣椒蛋白组学和分子生物学的研究奠定了重要的工作基础。

主权项

1.辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是包括以下步骤：1）、利用辣椒花药进行蛋白质的提取；2）、第一向IPG等电聚焦电泳：取步骤1）所得的蛋白提取液40μL、240～280μL的IPG buffer混匀后配成水化溶液，装入等电聚焦槽中；利用等电聚焦胶条进行等电聚焦；设定参数如下：所述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入380mg尿素、15mg的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5.5mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10；3）、胶条的平衡：①、配制平衡缓冲液：在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.45mol/L，pH8.8）中加入6mol的尿素，150ml的甘油，25g的十二烷基硫酸钠，得平衡缓冲液；②、在10ml平衡缓冲液中加入80mg二硫苏糖醇均匀混合后，将步骤2）的等电聚焦完成后的胶条置于上述含二硫苏糖醇的平衡缓冲液中振荡平衡20min；③、在10ml平衡缓冲液中加入200mg碘乙酰胺均匀混合后，将步骤②所得的胶条放入上述含碘乙酰胺的平衡缓冲液中，再振荡平衡20min；④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗，干燥；4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶，得转移后胶条；②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；所述琼脂糖封顶液的制备方法为：在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.2mg的溴酚蓝；然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，进行第二向电泳（恒流30mA，4～5h）；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；所述电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入2g Tris base、12.3g甘氨酸和0.8g SDS。③、第二向电泳结束后，将凝胶放置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色10～14小时；倒掉染色液，加入脱色液，继续振荡脱色，每隔20min换一次脱色液，直至凝胶背景透明；所述脱色液由35％乙醇、20%乙酸和45％超纯水组成，上述%为体积%；所述考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于350ml甲醇、100ml乙酸和550ml超纯水中；5）、凝胶扫描和图像分析：包括将考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，从而得辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱。