[发明专利]一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法

摘要

本发明公开了一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，特别是高产十二碳二元酸（DC12）的方法。通过下述方案予以实现：将维斯假丝酵母（Candida viswanathii）培养成的种子液接入pH5.0‑8.5含有5‑40%（v/v）10‑18个碳原子的正烷烃和95‑60%（v/v）包括糖质多元底物做生长碳源的液体发酵培养基混合液中；上述混合液在24‑40℃、通气量0.1‑3.0vvm下培养42‑194h，启动发酵与膜分离耦合装置，经耦合装置分离后的细胞循环回发酵罐，经耦合装置分离后的透过液进入提取环节制备长链二元酸，同时向发酵罐中补充培养基继续发酵过程。本方法用于转化正十二烷生产DC12时，产酸达250g/L，产酸速率大于1.6g/h·L，提高了发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期，提高合成二元酸的生产强度，未被利用的正烷烃也同时返回至发酵过程。 1

主权项

1.一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，包括如下步骤：

（1）将维斯假丝酵母ipe‑1（Candida viswanathii ipe‑1）培养成的种子液接入pH5.0‑8.5含有5‑40%（v/v）10‑18个碳原子的正烷烃和95‑60%（v/v）包括糖质多元底物做生长碳源的液体发酵培养基混合液中；

（2）上述混合液在24‑40℃、通气量0.1‑3.0vvm下发酵42‑194h，启动发酵与膜分离耦合装置，采用分批补料发酵、半连续发酵或连续发酵的形式，经耦合装置分离后的细胞循环回发酵罐，经耦合装置分离后的透过液进入提取环节制备长链二元酸，同时向发酵罐中补充液体发酵培养基继续发酵过程；

（3）在上述发酵过程中，通过连续或间歇的方式补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终大于等于1%（v/v）。

2.根据权利要求1所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用发酵与膜分离耦合装置中的膜为微滤膜或超滤膜。

3.根据权利要求1所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的分批补料发酵指的是发酵过程中通过连续或间歇的方式补加正烷烃和液体发酵培养基的混合液或仅补充正烷烃，直至发酵罐允许最大体积，当发酵罐中产物浓度未达到其最大发酵浓度时，采用分离耦合装置移除一定的发酵体积直至发酵初始体积，之后继续补料发酵过程，该过程反复进行，直至达到产物最大发酵浓度时终止该发酵过程；

所述的半连续发酵指的是在发酵进行42‑194h时，通过分离耦合装置移除产物二元酸，直至分离耦合装置死体积时，采用0‑3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，然后将菌体全部返回发酵罐中，并一次性补加权利要求1步骤（1）中的包括烷烃和液体发酵培养基的发酵成份，继续发酵过程，该过程反复进行；

所述的连续发酵指的是发酵进行42‑194h时，通过分离耦合装置移除已合成的二元酸，同时连续向发酵体系内补充权利要求1中的液体发酵培养基，以连续或间歇的方式补加正烷烃，并以维持发酵液体积恒定、维持发酵液中残留二元酸浓度恒定或维持发酵液中残留烷烃浓度恒定的方式连续进行发酵过程。

4.根据权利要求1所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基包括糖质10‑90g/L，金属磷酸盐2‑10g/L，酵母膏1‑6g/L，玉米浆1‑3g/L，尿素0.5‑1.5g/L，NaCl0.5‑1g/L,硝酸盐1‑10g/L，吐温0.5‑1.5。

5.根据权利要求4所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：发酵培养基中所述的糖质是葡萄糖、蔗糖或半乳糖；硝酸盐是KNO₃或NaNO₃；吐温是吐温60或吐温80；金属磷酸盐是钠盐或钾盐；

6.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的微滤处理中的压力是0.01‑0.2Mpa；所述的超滤处理的压力是0.1‑1.0Mpa。

7.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用微滤膜的孔径为0.1‑1μm的有机或无机膜；采用超滤膜截留分子量为1‑1,000KDa的有机或无机膜。

8.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用的膜组件的型式为平板式、外压中空纤维式或管式。

9.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用的膜材料为：聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈有机膜，氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质陶瓷膜，Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜。

10.根据权利要求1或3所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的正烷烃含有12‑17个碳原子或其混合物。