[发明专利]一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法

摘要

一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法：冷冻干燥法制备不同浓度配比的壳聚糖-明胶支架，扫描电镜观察支架表面特征，测量支架的孔径大小、并计算孔隙率、吸水率以及相容性测定，选取适合脐血干细胞生长的支架，用磁珠分选的方法对人脐血CD34+细胞进行分离鉴定，将脐血CD34+细胞附着在壳聚糖-明胶支架上，或者将转染了细胞因子的骨髓基质细胞和脐血CD34+细胞附着在壳聚糖-明胶支架上，放入RCCS系统进行三维培养体系(3D)培养，倒置显微镜观察细胞形态，扫描电镜观察细胞在支架上的粘附生长状况，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞标志物，以及对分化所得的血小板进行形态及功能鉴定，并与二维培养体系(2D)进行比较。

主权项

一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法，包括以下步骤：1)冷冻干燥法制备不同浓度配比的壳聚糖‑明胶支架，包括以下步骤：a.称取一定量的壳聚糖和明胶；取消毒后的无菌锥形瓶一支，加入100ml的去离子水，然后将称量的壳聚糖和明胶加入，用玻璃棒搅拌，直到看不见白色粉末；电热恒温水浴箱加热到50℃，将盛有混合液的锥形瓶放入浸泡过夜；b.将锥形瓶口用封口膜密封，然后用无菌包布包裹后进行高压蒸汽灭菌；待灭菌后的壳聚糖明胶溶液冷却后，无菌注射器抽取1.15ml冰醋酸注射到溶液内，使其终浓度为0.2mol／L；磁力搅拌器配备的搅拌子用酒精擦拭消毒三遍；将搅拌子放入盛有壳聚糖明胶溶液的锥形瓶内，然后置放于磁力搅拌器上，接通电源，调整频率，使壳聚糖、明胶、冰醋酸充分混匀；c.取12孔板，将溶液倾倒入内，每个孔的注入量不超过2／3体积，将12孔板盖上孔盖，封口膜包裹，立即放置速冻冰箱内速冻15min，速冻成半固状后将12孔板再转冻存于不同温度的低温冰箱24h，取出12孔板，将孔盖取下，平放于真空冷冻干燥机内冻干24h，干燥后的12孔板置超净台中，通风24h，取治疗盘一个，装入0.25％戊二醛的PBS溶液，将治疗盘放在振摇床上，12孔板全部浸泡在溶液内，开启振摇床开关，使其室温振摇交联6h；d.1％硼酸氢钠脱醛3次，每次15min，去离子水洗涤3次，每次15min，将12孔板再次冷冻干燥，方法同步骤9‑11，冷冻过夜即可，选取部分构建好的支架样本，进行切片，离子贱射喷金，扫描电镜观察；2)三维培养体系诱导脐血CD34+体外生成血小板，包括以下步骤：a.脐血单个核细胞的分离：b.磁性标记细胞：①每108个细胞在300μl buffer中重悬，加入FcR阻断剂100μl，然后加入CD34微珠100μl标记细胞，终体积为每108个细胞500μl，②轻轻混悬，6℃孵育，30min，③加入标记体积10倍量的buffer洗涤细胞，离心，1000rpm，10min，④完全去除上清，每108个细胞用500μl buffer重悬，C.磁性分选①MS分选柱放置在MACS分选器对应的磁场中，②用500μl buffer充分润湿分选柱，③将标记好的细胞悬液匀速加入分选柱中，避免产生气泡；阴性细胞成分先行流出，④用3×500μlbuffer冲洗分选柱，3次，⑤将MS分选柱移出磁场，放置在空白的采集管上，⑥在分选柱内加入buffer1ml，用MS分选柱配备的活塞加压迅速推出磁性标记细胞，⑦重复上述分选步骤，用新的阳性分选柱分选洗脱出来的阳性细胞，进行二次分选，得到纯度高的阳性细胞，加入500μl buffer将阳性细胞推出，并进行细胞计数，获得(1.05+0.72)×106个阳性细胞；d.支架的预处理刀片切割支架，支架浸泡在乙醇中溶液，PBS洗涤3次，每次5min，支架过夜浸泡在IMDM培养基中，将STLV容器全部打开，所有的组件置于超纯水中浸泡过夜；无水乙醇中浸泡24h，组装好后进行高压蒸气灭菌，使用前在无血清培养基中浸泡过夜；3)三维培养体系培养取12孔板，每孔按照2D模式下的培养加样，接着将壳聚糖／明胶支架置孔板内，并用无菌镊子将支架夹紧，再放松，重复此步骤5次，使更多细胞进入并粘附在支架上，置37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育2h，再将细胞与支架移入RCCS装置的STLV培养皿内中培养，整个装置放入5％CO2细胞培养箱中，接通电源，调节转速，初始转速为15rpm，随后根据细胞增殖状态进行调整，每3d全量更换培养液和细胞因子。