[发明专利]一种DON及乙酰化DON毒素的培养制备及提取方法

摘要

本发明涉及一种DON毒素及其乙酰化衍生物的制备纯化方法。在本发明中，通过种子培养基中玻璃珠的引入，能简便有效的抑制禾谷镰刀菌菌丝的产生，从而保证诱导主要生成大型分生孢子，有效获得种子液。本发明采用硅胶柱分离毒素粗提液，通过一步洗脱分离、分段收集不同流份可分别获得乙酰化DON毒素和DON毒素，并采用一步结晶法制备毒素纯品，其中乙酰化DON毒素结晶体系为乙酸乙酯和正己烷混合体系，DON毒素结晶体系为正己烷和乙醚混合体系。本发明改变常规多步骤分离洗脱的繁琐方法，采用一步洗脱分段收集及简单结晶法从毒素粗提取液中同时制备了两种毒素，从而提供一种切实有效的、大量制备纯化DON及乙酰化DON毒素的简便方法。

主权项

1.一种同时制备DON毒素及其乙酰化衍生物的方法，其特征在于培养禾谷镰刀菌产生DON毒素及乙酰化DON毒素，培养中使用的种子培养基中加入玻璃珠并进行震荡培养；并且采用硅胶柱一步洗脱分段收集的方法，从毒素粗提液中同时分别制备DON毒素和乙酰化DON毒素，具体制备纯化方法是：a)将禾谷镰刀菌活化，接种于种子培养基中，于25℃，200‑250rpm摇床震荡培养3‑5天获得种子液，培养基中预先放置玻璃珠，所述种子培养基为能促进禾谷镰刀菌分生孢子生成的液体培养基；b)收集种子液，过滤，离心，重悬，获得分生孢子液；c)接种分生孢子于无菌米饭培养基中，20‑25℃静置培养，每天拍打瓶子底部防止培养基结块，10‑60天后获得产毒培养物；d)分别采用70％甲醇和纯甲醇溶液浸泡、超声所述培养物，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入饱和氯化钠水溶液，静置后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取二次，将萃取所得的乙酸乙酯合并浓缩，得毒素的粗提取液；e)使用硅胶柱精制毒素粗提液，使用薄层色谱(TLC)方法跟踪检测，分别收集含有乙酰化DON毒素和DON毒素的流份，旋转蒸干，结晶获得纯化的乙酰化DON毒素和DON毒素，其中，所述硅胶柱是指硅胶柱的硅胶粒径选择100‑300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要作相应调整；含有乙酰化DON毒素和DON毒素的流份是指收集流份的起始点和终止点需重新通过薄层色谱(TLC)鉴定方法加以确定；使用硅胶柱精制粗提液以及结晶的具体步骤为：1)湿法制备硅胶柱，将毒素粗提液上样，以二氯甲烷和四氢呋喃体积比为10:3的混合洗脱液一步洗脱，保持流速约1mL/min；2)收集第30～80mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有乙酰化DON毒素的情况，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩至获得棕红色油状物；3)另干法制备硅胶柱，将2)中制备的棕红色油状物上样，以正己烷和乙酸乙酯混合液常压洗脱，收集第60～100mL流份，旋蒸至干，获得淡黄色油状物，将该产物在乙酸乙酯和正己烷的混合体系进行结晶，获得纯化的乙酰化DON；4)经1)步骤收集第200～330mL流份洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON毒素的情况；合并含有DON毒素的收集管并旋转蒸干，在正己烷和乙醚体系中进行结晶，获得纯化的DON毒素。