[发明专利]一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法

摘要

本发明公开了一种从海洋微生物发酵液中筛选1‑脱氧木酮糖‑5磷酸消旋酶抑制剂的方法，具体为，1）海洋微生物发酵液样品的制备：接种真菌，发酵，提取代谢产物，浓缩，洗脱；2）以创伤弧菌全基因组为模板，设计引物PCR扩增后，克隆入载体，转化大肠杆菌后诱导目的蛋白表达，目的蛋白经洗脱，透析，超滤，除盐得到His‑DXR；3）将菌悬液、刃天青溶液和1）所得进行反应后测定其荧光值并通过公式计数出抑制率，筛选出抑制率在80%以上的馏分；4）将步骤3）筛选的馏分与步骤2）所得His‑DXR进行反应，计算抑制率；筛选出抑制率≥50%的馏分。本方法简单准确，为发现以Dxr为靶点的新型抗菌药物或先导化合物奠定基础。 1

主权项

1.一种从海洋微生物发酵液中筛选1‑脱氧木酮糖‑5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤，1)海洋微生物发酵液样品的制备：海水PDA液体培养基接种真菌，培养后作为种子液继续发酵，待真菌发酵成熟后，提取代谢产物；并提取胞内物质，提取的液体浓缩至浸膏，得到初级浸膏；初级浸膏利用正相硅胶柱进行等度洗脱，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压浓缩，得到初级馏分；初级馏分使用反相C18制备柱进行梯度洗脱，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压蒸馏至浸膏，得到次级馏分，次级馏分溶于DMSO使之达到次级馏分蒸馏前的体积即为海洋微生物发酵液样品；2)His‑DXR的制备：以创伤弧菌全基因组为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增后，克隆入pET‑22b载体得到重组质粒pET22b‑DXR；将重组质粒pET22b‑DXR转化大肠杆菌后用IPTG诱导，离心收集菌体细胞后重悬，进行超声裂解菌体，离心收集上清，将上清经过Ni2+‑NTA亲合层析柱洗脱，收集到目的蛋白溶液His‑DXR并溶于透析液中，用Amicon Ultra‑4Centrifugal Filter Devices反复离心超滤除盐，得到His‑DXR；3)抑菌活性筛选：将175μL菌悬液、20μL刃天青溶液和5μL步骤1)所得海洋微生物发酵液样品同时加入到96微孔板中；同时设定阴性和阳性对照，恒温培养箱中培养24小时后，在酶标仪中的激发波长为530nm，发射波长为590nm处测定其荧光值，并通过公式计数出抑制率，筛选出抑制率在80％以上的馏分留做下一步酶活筛选；所述菌悬液为轮虫弧菌或坎式弧菌或创伤弧菌悬液；阴性对照为：5μL DMSO+175μL菌悬液+20μL刃天青；阳性对照为：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青；4)酶活抑制试验筛选：将步骤3)筛选出的馏分溶于DMSO中配置待筛选馏分，在含有Tris‑HCl缓冲液，MgCl2，DTT，NADPH及DXP，一定pH的反应液中，分别加入待筛选馏分，加入步骤2)所得His‑DXR开始反应，在340nm下测定吸光值，设置对照和空白组，对照组以DMSO代替待筛选馏分，空白组不加His‑DXR，重复三次，计算抑制率；≥50％的酶活抑制率的馏分即为筛选到的1‑脱氧木酮糖‑5磷酸消旋酶抑制剂；所述抑制率的计算公式为：抑制率％＝100％‑(实验孔荧光值‑阳性对照荧光值)/(阴性对照荧光值‑阳性对照荧光值)×100％。