[发明专利]一种神经干细胞的大规模制备方法

摘要

本发明涉及一种神经干细胞的大规模制备方法及其在细胞移植、干细胞培养、扩增、定向分化和神经系统疾病治疗领域的用途。本发明所述的神经干细胞，该干细胞是按以下步骤制备的：从幼年动物或胚胎脑组织中采用机械法、酶法和机械-酶法和密度梯度离心法，联合提取神经干细胞；体外大规模培养，扩增，经神经干细胞鉴定后冻存备用。本发明所述方法比常规方法制备神经干细胞效率提高约10-1000倍，可用于组织工程学研究、神经干细胞制剂或干细胞药物的生产。

主权项

一种规模化制备神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、幼年动物或胚胎脑组织，称重，按1：2加入0.1M/L磷酸盐缓冲液（PBS），采用电动机械法绞碎或匀浆；B、离心，去上清，沉淀用10‑100倍体积的0.01%的胶原酶或胰酶37℃搅拌消化30分钟，离心，用0.1M PBS洗涤1～3次；C、用10‑100倍体积的0.1MPBS液将沉淀洗出，加胶原酶、蛋白酶K、DNase继续搅拌消化30分钟，0.1M PBS洗涤3次，沉淀用10‑100倍体积的0.1MPBS洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后取细胞悬液进行细胞计数；D、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和牛血清白蛋白，当培养中神经干细胞生长为神经细胞球后，采用胰酶消化法收集神经干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；E、进行大规模（摆瓶法、转瓶法或发酵罐法）细胞扩增，同时保持细胞未分化；F、当细胞扩增10‑100倍后收集细胞，按1‑2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用；G、细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，符合神经干细胞的特征。