[发明专利]转基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法

摘要

本发明涉及一种转基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法,由Tier-1毒性测定试验，三级营养试验，蛋白传递规律，捕食功能反应以及种群密度与种群动态比较5个部分组成。各部分分别评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对黑肩绿盲蝽的潜在毒性；评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对黑肩绿盲蝽的影响；评价黑肩绿盲蝽暴露于Bt蛋白的途径和程度；评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽种群的影响。最终，根据5个方面的数据综合评价所述转基因作物的种植对该非靶标生物产生的生态后果。本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转基因作物对非靶标生物的影响研究以及确定转基因作物种植的生态安全性具有重要意义。

主权项

转基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法，其特征在于包括如下5个部分：(1)Tier‑1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物黑肩绿盲蝽的潜在毒性；用人工饲育器饲养黑肩绿盲蝽，接入黑肩绿盲蝽试虫，饲养时饲育器用黑布罩住，仅露出有饲料的端口，且朝光照方向，保持相对湿度达90%以上，再置于温度28±1℃、光周期L:D=14:10h，湿度90±5%的智能人工气候箱内培养；用三种形式的全纯人工饲料作为黑肩绿盲蝽的饲料即：全纯人工饲料、含有转基因水稻叶鞘组织表达的Bt蛋白浓度10倍以上及含有40μg/ml砷酸二氢钾的全纯人工饲料；用含有褐飞虱卵的稻苗将黑肩绿盲蝽饲养至2龄若虫，单头接入饲养装置中，每个处理各接黑肩绿盲蝽若虫36头，每日更换饲料并观察记录黑肩绿盲蝽蜕皮及存活情况，直至羽化，新羽化成虫在24小时内，2～3头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重；试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测杀虫蛋白的浓度、稳定性以及生物活性；选择黑肩绿盲蝽的若虫发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，对其进行统计分析，以评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对黑肩绿盲蝽的毒性影响；(2)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—黑肩绿盲蝽的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对黑肩绿盲蝽的安全性影响；①以褐飞虱卵作为食物向装有6～7根15日龄稻苗的玻璃管中接入2头已过产卵前期的褐飞虱雌成虫，产卵2天，分别以不同水稻品种、系的产卵苗饲养黑肩绿盲蝽的若虫至成虫；每个玻璃管内接入孵化24h以内，来自非转基因亲本水稻的黑肩绿盲蝽若虫1头，每个品种、系各接黑肩绿盲蝽若虫32头，在黑肩绿盲蝽的1～3龄若虫期，每2天更换1次产卵苗，在4龄至成虫期每天更换1次产卵苗；每天上午观察记录黑肩绿盲蝽若虫的存活和蜕皮情况，直至若虫羽化，新羽化成虫24小时内，2～3头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重；选择黑肩绿盲蝽的若虫发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱卵介导的转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽的安全性影响；②以褐飞虱若虫作为食物每日提供在不同水稻品种、系上孵化并取食24～48小时的褐飞虱若虫作为食物饲喂黑肩绿盲蝽，具体操作如下：用含有褐飞虱卵的稻苗将黑肩绿盲蝽饲养至2龄若虫，再喂以不同水稻品种、系的褐飞虱若虫，2～3龄黑肩绿盲蝽若虫期每日每头提供10头褐飞虱若虫，4龄黑肩绿盲蝽到成虫期每日每头提供20头褐飞虱若虫，黑肩绿盲蝽若虫单头饲养于底部铺有湿海棉保湿的指型管中，每个品种、系各接黑肩绿盲蝽若虫80头，每天上午观察记录黑肩绿盲蝽若虫的存活和蜕皮情况，直至若虫羽化，新羽化成虫24小时内，3～5头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重；选择黑肩绿盲蝽的若虫发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽的安全性影响；(3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定黑肩绿盲蝽暴露于Bt蛋白的途径和程度；于玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的20头怀卵褐飞虱雌成虫，产卵2天后接入3～4龄黑肩绿盲蝽，取食3天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱卵，黑肩绿盲蝽进行取样，每个处理重复4～5次；将不同水稻品种、系饲养孵化后24～48小时的褐飞虱若虫与3～4龄黑肩绿盲蝽同时接入含有对应稻苗的玻璃罐中，每日更换褐飞虱，取食3天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱若虫以及黑肩绿盲蝽进行取样，每个处理重量4～5次；采用ELISA技术，分别对以上样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过不同的食物链黑肩绿盲蝽暴露于Bt蛋白的程度；(4)捕食功能反应：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照品种饲养的黑肩绿盲蝽捕食功能参数，评价转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物的影响；黑肩绿盲蝽分别于不同水稻材料饲养一代，羽化后2天且已交配的雌虫用于试验，试验前饥饿处理24小时，将黑肩绿盲蝽单头放入底部铺有海棉且含有稻苗的指形试管，1龄褐飞虱若虫作为猎物；5个猎物密度处理，分别为10、20、30、40、50头，每个密度处理重复5次，24小时后计录被捕食的褐飞虱若虫数；选择黑肩绿盲蝽的瞬时攻击率和处理猎物时间作为评价参数指标，并进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽捕食功能反应的影响；(5)种群密度与种群动态比较：通过比较，转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照稻田黑肩绿盲蝽的发生动态，评价转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物种群的影响；采用对角线取样法，每小区面积为150m²，每次取5个样，每样0.25m²，约6丛稻株；水稻移栽后30天开始用吸虫器取样，至水稻收割前10天，共取样5～7次；取样立即用75%的酒精保存，在体视镜下进行鉴定并计数，以统计黑肩绿盲蝽种群密度及种群动态，并对不同水稻稻田之间参数的差异性进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽田间种群的安全性影响。