[发明专利]一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用

摘要

本发明公开了一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用。本发明先设计特异性引物，PCR扩增获得ε毒素基因片段克隆到pMD18-T Vector载体后，选取阳性重组子，将重组质粒导入受体菌株，成功构建重组菌株BL21(DE3)-ε。最后将制取好的ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，加入0.01%的硫柳汞，即得产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，具有易于工业化生产，操作简单，安全性好等优点，产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗可应用在因预防因D型产气荚膜梭菌引起的羔羊、绵羊、山羊、犊牛以及灰鼠等动物的致死性肠道疾病。

主权项

一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，其特征在于是将产气荚膜梭菌ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9:1的比例进行乳化,每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到；所述的产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的制备步骤如下：1）设计引物根据Genebank上已经提交的ε毒素基因序列(登录号：M95206)扩增ε毒素部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Ecor1和Xho1酶切位点；primer1：5’‑ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA‑3'Ecor1primer2：5’‑ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA‑3'Xho12）制备模板和PCR扩增目的基因用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7‑8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；3）将ε毒素目的DNA克隆到pMD18‑T Vector载体将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18‑T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18‑T‑ε；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18‑T‑ε；4）构建原核表达载体pET28a‑ε将阳性重组质粒pMD18‑T‑ε与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a‑ε；将pET28a‑ε与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)‑ε；5）ε毒素蛋白的诱导表达、纯化用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达8h，经Ni‑Agarose His标签蛋白纯化柱纯化得到ε毒素蛋白。