[发明专利]头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条及其制备

摘要

本发明公开了一种快速、灵敏、操作简便的头孢氨苄残留量的荧光免疫层析检测试纸条及其制备，该试纸条包括在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线和质控线，结合垫上涂覆有荧光标记的头孢氨苄单克隆抗体。该头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法包括：头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原的合成，羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备，而后包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备，后涂覆于玻璃纤维上作为结合垫；在背板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；得到的试纸条切割成4mm宽度于常温保存。

主权项

一种头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：在背板上依次粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线为头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原和质控线为羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体。头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条中各部分含有以下成分：A.结合垫，上面涂覆有荧光标记抗体，所述标记抗体为稀土荧光纳米颗粒与头孢氨苄特异性抗体采用化学交联法进行连接得到的偶联物，具体制备过程为：(1)头孢氨苄‑牛血清白蛋白免疫抗原的合成：将头孢氨苄和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亚胺法进行偶联得到免疫抗原。取头孢氨苄15mg溶于5mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入25mg碳二亚胺(EDC)和10mg N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌30分钟，取BSA10mg溶于活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，再4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄免疫抗原，分装冻存；(2)动物免疫：采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄‑牛血清白蛋白偶联物为免疫原；(3)细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株10⁶个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，‑20℃保存；(5)免疫探针制备：取荧光纳米颗粒用碳酸盐缓冲液pH9.5离心洗涤，悬浮，加入醛基化的葡聚糖反应4h，加入上述头孢氨苄单克隆抗体混合4℃过夜。加入硼氰化钠溶液于4℃反应4h，洗涤、4℃储存，备用。B.硝酸纤维素膜，上面包被有检测线和质控线，检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法进行偶联得到的包被原，质控线为羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)，具体制备过程为：(1)头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原的合成：将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。取头孢氨苄10mg溶于5mLPBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入1％戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于1mLPBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存；(2)羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成；(3)分别用包被稀释液将头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体调节到0.3‑1.0mg/mL，膜液量为25μL/25‑30cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4‑7mm，然后于37℃下烘干2小时。C.样品垫，具体处理为：将玻璃纤维膜浸泡于0.2mol/LTris‑HCl(pH7.8)，1.0％TritonX‑100，3.0％BSA的处理液中，于4℃条件下浸泡2小时；然后于37℃下烘干2小时，备用。