[发明专利]一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用

摘要

本发明涉及一种生产α‑酮基丁酸的基因工程菌及其构建方法和应用，利用该菌株发酵生产α‑酮基丁酸具有较高的生产效率，属于生物技术领域。所述基因工程菌是对大肠杆菌Escherichia coli MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL。使用该菌采用发酵法生产α‑酮基丁酸能够克服化学合成法、酶法或微生物转化法存在的反应条件复杂、能耗大、污染重或生产成本高污染大等不足，在发酵20‑24h后，α‑酮基丁酸产量达到8.5‑15.7g/L，该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接发酵法生产α‑酮基丁酸的报道。

主权项

一种基因工程菌在发酵生产α‑酮基丁酸中的应用，其特征在于，所述基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，并敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL；所述应用包括以下步骤：①种子培养：将所述的基因工程菌经活化后接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8‑7.2，溶氧维持在30‑50％，通风量3‑5m3/h，搅拌转速200‑600rpm，32‑37℃培养6‑8h；②发酵罐发酵：以5％‑10％接种量将步骤①的种子培养物接至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32‑37℃，通风量3‑5m3/h，搅拌转速300‑1000rpm，溶氧维持在30‑60％，流加浓度为60‑80％的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1‑0.5％(W/V)，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8‑7.2，发酵周期20‑24h；③发酵液中α‑酮基丁酸的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，采用UltiMate 3000Thermo Scientific高效液相色谱仪测定α‑酮基丁酸的含量；检测条件为：色谱柱REzex RoA‑organic Acid H+，流动相5mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测波长215nm，进样量为20μL；所述种子培养基成分为：蔗糖15‑25g/L，玉米浆15‑25mL/L，酵母粉1‑4g/L，(NH4)2SO41‑4g/L，KH2PO4 0.5‑1.5g/L，MgSO4 0.1‑0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01‑0.05g/L，MnSO4·H2O0.010.05g/L，pH 7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min；所述发酵培养基成分为：葡萄糖15‑45g/L，酵母粉1‑2g/L，豆饼水解液5‑15mL/L，玉米浆5‑15mL/L，KH2PO4 1‑5g/L，柠檬酸0.5‑2g/L，MgSO4 0.5‑1g/L，FeSO4·7H2O 0.1‑0.5g/L，MnSO4·H2O 0.1‑0.5g/L，pH 7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。