[发明专利]增强型DCIK细胞制备方法及其细胞制剂

摘要

本发明公开了一种增强型DCIK细胞制备方法以及细胞制剂，该方法从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中培养，得到浓度1～3×10⁶/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中培养24h；然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养3～5后控制细胞密度在1～6×10⁶/ml，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型CIK细胞。该增强型DCIK细胞制剂包括增强型DCIK细胞、人血白蛋白、IL-2、氨基酸、维生素和无机盐。DCIK制剂在保存时间上较上述专利中的制剂有显著提高。在室温情况下从6小时提高到36小时。在临床应用中可靠性更高，安全性得到有效保障。

主权项

一种增强型DCIK细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×10⁶/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养2‑3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL‑4和GM‑CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF‑α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，，得到浓度1～3×10⁶/ml的核细胞，加入IFN‑γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN‑γ的浓度：100～2000u/ml，PHA的浓度：10ng～50μg/ml，PGE2的浓度：1ng～50μg/ml； 2）然后加入CD3单抗，IL‑2和IL‑1α，继续培养；其中，CD3单抗的浓度：1ng～20μg/ml，IL‑2的浓度：10～10000IU/ml，IL‑1α的浓度：1ng～50μg/ml； 3）培养3～5天后，添加含有IL‑2无血清培养基，控制细胞密度在1～6×10⁶/ml，其中：所述IL‑2的浓度：10～10000IU/ml； 4）第7天开始每隔2‑3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL‑2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型DCIK细胞，其中：所述IL‑2的浓度为10～10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg～1mg/L。