[发明专利]一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用，属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。其特征在于：（1）铜掺杂二氧化钛Cu@TiO₂的制备；（2）双功能标记物-二抗孵化物Cu@TiO₂-Ab₂的制备；（3）双功能标记物构建的免疫传感器的制备及分析应用。本发明双功能标记物构建的免疫传感器优点在于识别快速、灵敏度高、检测限低、成本低、便于操作，能实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性、快速准确检测。

主权项

一种双功能标记物‑二抗孵化物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）二氧化钛纳米材料的制备将2 mL钛酸丁酯加入40~50 mL乙二醇中，室温搅拌6~8 h制成混合物，将混合物加入150~170 mL的丙酮中，加2~3 mL水，剧烈搅拌1~2 h，离心分离，用乙醇清洗2~4 次，50℃干燥，制得二氧化钛前驱体；将0.1 g二氧化钛前驱体分散到20 mL水中，搅拌条件下加热回流1~2 h；再经过离心分离，乙醇清洗2~4 次，50℃干燥，制得二氧化钛纳米材料，备用；（2）铜掺杂二氧化钛Cu@TiO₂的制备将1 g 二氧化钛纳米材料加到40 mL、10 mol·L^‑1 的NaOH溶液中，搅拌2~3 h，装入聚四氟乙烯的反应釜中， 120~140℃加热18 ~ 24 h，取出、冷却至室温，用8~12 mL、0.1 mol·L^‑1 HCl溶液搅拌处理，超纯水洗涤至中性，60℃下干燥，得到处理过的二氧化钛纳米材料；将乙二胺（en）和Cu(OH)₂以化学计量比2:1的比例混合制得Cu(en)₂(OH)₂溶液，将0.8 g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL 制得的Cu(en)₂(OH)₂溶液中，搅拌1~2 h，得到蓝色物质，离心分离，用水清洗数次后，在400~500℃下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛Cu@TiO₂；（3）双功能标记物的制备将0.25 g Cu@TiO₂、0.5 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯，在氮气保护下，120℃搅拌回流4~6 h，用甲苯和超纯水各清洗2~4次，50~60℃下干燥，制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛Cu@TiO₂，即双功能标记物；所述的双功能标记物，其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测；二是利用二氧化钛上的铜离子催化H₂O₂产生的信号，采用计时电流法对分析物进行检测；（4）双功能标记物‑二抗孵化物Cu@TiO₂‑Ab₂的制备将1 mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合，振荡1~2 h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL、pH7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5 µL分析物的二抗（Ab₂），振荡10~12 h后离心分离，用pH 7.0~7.8的PBS溶液定容至1 mL，制得双功能标记物‑二抗孵化物Cu@TiO₂‑Ab₂，置于4℃冰箱中备用。