[发明专利]一种提取纯化Taq DNA聚合酶的方法有效
申请号: | 201410180380.1 | 申请日: | 2014-04-30 |
公开(公告)号: | CN103966183A | 公开(公告)日: | 2014-08-06 |
发明(设计)人: | 魏劭;林家旺;魏超 | 申请(专利权)人: | 厦门安普利生物工程有限公司 |
主分类号: | C12N9/12 | 分类号: | C12N9/12;C12R1/19;C12R1/01 |
代理公司: | 厦门市精诚新创知识产权代理有限公司 35218 | 代理人: | 方惠春 |
地址: | 361000 福建省*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | 本发明提出了一种提取纯化TaqDNA聚合酶的方法。其步骤为:1)工程菌的活化和表达:取TaqDNA聚合酶工程菌活化,IPTG诱导表达将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT,吐温-20,冰上处理一段时间后离心得到粗蛋白;缓慢加入二氧化硅颗粒,磁力搅拌器上搅拌,离心去除沉淀;上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱,再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤,最后用洗脱液洗脱目的蛋白,接收含目的蛋白的洗脱液;脱盐后即得到纯化的TaqDNA聚合酶;得到的TaqDNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%,-20℃保存。本发明方法简单,酶活性损失小,回收蛋白的纯度、活性、回收量高。 | ||
搜索关键词: | 一种 提取 纯化 taq dna 聚合 方法 | ||
【主权项】:
一种提取纯化Taq DNA聚合酶的方法,其步骤为,1)工程菌的活化和表达:取Taq DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,200rpm振荡培养过夜;取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中,振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时;离心收集菌体;收集的菌体用缓冲液A洗涤一次,离心;再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌;2)粗蛋白制备:将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT,再加入吐温‑20,冰上处理一段时间,15000g/4℃/20分钟,得到的上清即为粗蛋白;3)粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒,磁力搅拌器上搅拌,离心去除沉淀;4)上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni‑NTA柱,该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡;所述结合缓冲液为20mM Tris‑HCL,0.5MNaCl,PH8.0,5mM咪唑;再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤,所述洗涤缓冲液为20mM Tris‑HCL,0.5MNaCl,PH8.0,50mM咪唑;最后用洗脱液洗脱目的蛋白,所述洗脱液为20mM Tris‑HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑,接收含目的蛋白的洗脱液;含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐,脱盐缓冲液为缓冲液B: 10mM Tris‑HCl ,pH 7.5 ,25°C, 300mM KCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,0.5mg/ml BSA;脱盐后即得到纯化的Taq DNA聚合酶;任选的,得到的Taq DNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%,‑20℃保存。
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