[发明专利]一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法在审
| 申请号： | 201410180381.6 | 申请日： | 2014-04-30 |
| 公开（公告）号： | CN104250642A | 公开（公告）日： | 2014-12-31 |
| 发明（设计）人： | 魏劭;林家旺;魏超 | 申请（专利权）人： | 厦门安普利生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/12 | 分类号： | C12N9/12;C12R1/19 |
| 代理公司： | 厦门市精诚新创知识产权代理有限公司 35218 | 代理人： | 方惠春 |
| 地址： | 361000 福建省*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | 本发明提出了一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法。步骤为：工程菌的活化和表达：取M-MLV逆转录酶工程菌进行活化后加入IPTG诱导表达得到表达的工程菌；用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20，冰上处理一段时间后离心，得到粗蛋白；粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀得到上清；上清移至已经预热至60℃的水浴锅中，孵育后离心，去除沉淀，得到上清；流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再进行脱盐得到纯化的M-MLV逆转录酶；得到的M-MLV逆转录酶可加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。本发明方法简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度、活性、回收量高。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 提取 纯化 mlv 逆转录 方法 | ||
【主权项】：
一种提取纯化M‑MLV逆转录酶的方法，其特征在于，包括如下步骤，1）工程菌的活化和表达：取M‑MLV逆转录酶工程菌进行活化后并振荡培养后加入IPTG诱导；洗涤；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温‑20，冰上处理一段时间后离心，得到的上清即为粗蛋白；3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀得到上清；4）将所述得到的上清移至已经预热至60℃的水浴锅中，孵育后离心，去除沉淀，得到上清；5）上清流过已螯合Ni2+的Ni‑NTA柱，再进行脱盐得到纯化的M‑MLV逆转录酶；所述缓冲液A为20mM Tris‑HCl，0.2M NaCl，pH 8.0； 任选的，得到的M‑MLV逆转录酶加入甘油使体积分数为50%，‑20℃保存。
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