[发明专利]空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测的方法，该方法利用抗血清和磁性微珠制备空肠弯曲杆菌和沙门氏菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕获检样中目的菌，无需增菌培养；本发明利用双重实时荧光PCR方法，分别设计空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的保守基因的特异性引物和检测探针，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的污染；本发明方法简便易行，可在一个工作日内完成，特异性好，敏感度高，是一种适用于检验检疫、疾病预防和动物产品安全检验等领域的快速技术方法。

主权项

空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获‑双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）免疫磁珠的制备：1）分别制取沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体；2）将磁珠分别与上述沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合；3）将孵育的磁珠洗涤干净，4℃保存，即可分别获得沙门氏菌和空肠弯曲杆菌的免疫磁珠；（2）目的菌的磁捕获 1）将待检样品离心，弃上清，沉淀重悬于含BSA的 PBS缓冲液中；2）取上述待检悬液加入含空肠弯曲杆菌免疫磁珠和沙门氏菌免疫磁珠悬液的试管中，室温振荡孵育使目的菌与免疫磁珠结合完全，弃去液体；再加入含BSA的 PBS缓冲液将结合有目的菌的免疫磁珠清洗干净；3）将上述洗涤干净的免疫磁珠加入去离子水混匀，用于提取细菌DNA；（3）双重实时荧光PCR：1）细菌DNA模板的制备：将上述捕获有目的菌的磁珠于95～100 ℃裂解，冰浴10～15min，然后经离心取上清液，即为模板DNA；2）将上述获得的模板DNA进行双重实时荧光PCR反应，反应体系为：2.5 ×RealMasterMix (含内参染料ROX)  8μL，引物F‑1（10μM）                   1μL引物R‑1（10μM）                   1μL引物F‑2（10μM）                   1μL引物R‑2（10μM）                   1μL检测探针‑1（10μM）                 0.3μL检测探针‑2（10μM）                 0.7μL20 ×probe Enhancer solution            1μL模板DNA                           2μLddH₂O                              补至20μL；其中，引物F‑1、引物R‑1、检测探针‑1为空肠弯曲杆菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其序列如下：引物F‑1： 5' TGCTGAAGAGGGTTTGGGT‑3'引物R‑1：5' ACCCCTTCCAATAACTTCAATACT‑3'检测探针‑1：5' FAM TCCGAAGAAGCCATCATCGCACC TAMRA‑3'空肠弯曲杆菌检测探针序列的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团TAMRA；引物F‑2、引物R‑2、检测探针‑2为沙门氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其序列如下：引物F‑2：5'‑ATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATT‑3'  引物R‑2：5' ‑TGCTCGCCTTTGCTGGTT‑3'检测探针‑2：5'JOE ‑TTCAATGGGAACTCTGCCGGGATT‑TAMRA3'沙门氏菌检测探针序列的5'端标记有荧光报告基团JOE，3'端标记有荧光淬灭基团TAMRA；3）结果分析和判定：反应结束后，调整阈值，观察阴性对照品，其FAM、JOE荧光信号值没有明显变化、扩增Ct值不存在或在40以上，可判定该次实验可靠；检测样品中，若FAM荧光收集信号呈S型扩增曲线且Ct值<35，则该样品为空肠弯曲杆菌阳性，若35<Ct值<40，则该样品重做；若Ct值>40，则该样品为空肠弯曲杆菌阴性；检测样品中，若JOE荧光收集信号呈S型扩增曲线且Ct值<35，则为沙门氏菌阳性，若35<Ct值<40，则该样品重做；若Ct值>40，则为沙门氏菌阴性。