[发明专利]一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用，本发明的虫生真菌抗菌肽制品选用虫生真菌蝉花虫草为原料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经Sephadex G‑15柱层析、DEAE‑Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G‑50柱层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。该抗菌肽制品主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有抑菌活性。本发明具有简便快速，制备的抗菌肽纯度高、活性强的特点。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。

主权项

一种从虫生真菌制备抗菌肽制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)、菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d；用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液，血球计数法计算孢子浓度待用；其中，所述的菌株为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.8989的蝉花虫草(Ophiocordyceps sobolifera)022007‑9号菌株；(2)、发酵培养：将孢子浓度为6×107的孢子悬浮液1毫升接种到250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的组成为：蛋白胨5g/L，蔗糖20g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为蒸馏水；(3)、发酵液的处理：经过步骤(2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12 000rpm离心30min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，随后在4℃下，12 000rpm离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目；(4)、硫酸铵盐析：将步骤(3)用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60％，搅拌半个小时，静置过夜，随后在4℃下，12 000rpm离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液。