[发明专利]一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法

摘要

本发明属地层水微生物研究领域，为解决现有对环境中微生物多样性的研究存在较大局限性，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分微生物种类等问题，提供一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法。包括煤层水样采集，富集水样中的微生物菌体及提取其总DNA，用特异性引物扩增16SrDNA高变区，通过Illumina测序平台进行测序分析，对测序的原始数据处理后，获得水样中微生物的多样性及丰度。本发明有效检测出样品中丰度低的物种，在煤层水中鉴定的菌种在属水平上多于400个属，在研究煤层水中的微生物种类及丰度中有明显的优越性。适用于煤层、油气或页岩气地层等环境中微生物多样性和物种丰度分析。

主权项

一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法，其特征在于：步骤如下：（1）煤层水样采集：厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体完全置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，‑20^oC密闭保存；（2）微生物菌体的富集和DNA提取：无菌操作台上将采集的水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22µm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；用OMEGA^Ò水样DNA提取试剂盒提取滤膜上的微生物总DNA；（3）用特异性引物扩增16S rDNA V4高变区：设计16S rDNA V4高变区的特异性引物，扩增该高变区DNA片段；（4）Illumina平台测序分析：用带有Illumina通用接头序列的引物对扩增的高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列;（5）原始测序数据处理：使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列；根据序列的重叠关系，利用Velvet或AbySS拼接软件将净序列拼接成标签序列，即全长的V4区序列；（6）完成物种分类：通过16S rDNA V4高变区数据库比对，将非冗余的标签序列进行物种注释并聚类成操作分类单位，完成物种多样性和物种丰度分析。