[发明专利]一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法

摘要

本发明公开了一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛病毒性腹泻病毒。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～8所示)以及试剂盒(由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成)。本发明的方法，既可用于牛病毒性腹泻病毒气溶胶样本的分型检测，也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测，具有广泛的应用前景。

主权项

一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：步骤如下：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY‑T3‑B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY‑T3‑B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；所述通用型检测引物对的序列如下：上游引物RT‑F为5′‑TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA‑3′；下游引物RT‑R为5'‑CCCTATCAGGCTGTATTCGT‑3'；所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下：牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对：上游引物RT‑1‑F为5′‑TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT‑3′；下游引物RT‑1‑R为为5′‑GCCTCTGCAGCACCCTATCA‑3′；牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对：上游引物RT‑2‑F为5′‑AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA‑3′；下游引物RT‑2‑R为5′‑GTCTCTGCTACACCCTATCAG‑3′；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒；当所用特异性引物为牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对时，若对应于牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒I型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒I型；若对应于牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型。