[发明专利]一种适合于南疆特色果树高质量RNA分离的方法

摘要

本发明涉及一种适合于南疆特色果树高质量RNA分离的方法，该方法将“硼砂-CTAB”法和“改良CTAB”法结合在一起，即该发明的提取缓冲液中添加了硼砂，技术步骤的大体流程主要参考了“改良CTAB”法的流程。再结合南疆特色果树(核桃、香梨、扁桃、杏、苹果)自身特性，该发明重新确定了一套适合南疆特色果树(核桃、香梨、扁桃、杏、苹果)的高质量RNA分离技术体系，具体包括操作环境温度的确定、65℃温浴提取的时间确定、高速冷冻离心反复抽提的转速和时间确定以及高速冷冻离心沉淀RNA的转速和时间确定。该技术发明经过反复实验验证，重复效果非常稳定，重现性非常高，可操作性更强。

主权项

一种适合于南疆特色果树高质量RNA分离的方法，其特征在：具体包括以下步骤：(1)准备：将要进行RNA分离操作的室内温度控制在‑17℃，用于研磨样品的研钵于‑80℃预冷，用75％乙醇擦洗超净台，并紫外灯照射超净台30min，以下所有加样、吸上清操作(除了离心)均应在超净台内进行，高速冷冻离心机必须提前预冷至4℃；(2)在2mL离心管中加入1500μL硼砂‑CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液和26μLβ‑巯基乙醇，于恒温水浴锅中65℃温浴5分钟；(3)取出预冷好的研钵，先加入少许液氮再次预冷，同时加入1g样品和10％PVPP(聚乙烯比咯烷酮)，迅速研磨样品，其间，加2‑3次液氮反复研磨，将研磨成粉末状的样品加入预热好的离心管中，涡旋震荡混匀后，再次放回恒温水浴锅中65℃温浴5min，每一分钟颠倒离心管一次；(4)温浴结束后，于高速冷冻离心机中，10000r/min，4℃，离心10min；(5)转移离心管中的上清液到另一个2mL离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻微振荡混匀，于高速冷冻离心机中，10000r/min，4℃，离心10min；(6)重复第5步一次；(7)转移离心后的上清液到另一个2mL离心管中，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次，即加完氯仿∶异戊醇(24∶1)后，轻微振荡混匀，于高速冷冻离心机中，10000r/min，4℃，离心10min，重复操作两次；(8)转移上清到另一个1.5mL离心管中，加入上清液0.6倍体积的异丙醇，轻轻摇匀，‑20℃下沉淀RNA，30min；(9)于高速冷冻离心机中，12000r/min，4℃，离心20min，倒掉上清，用500μL75％乙醇漂洗沉淀1‑2次，12000r/min，4℃，离心10min；(10)用移液器将离心后剩下的乙醇吸干，在超净台内挥发5min，沉淀干燥后，用40μLDEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的超纯水溶解RNA沉淀；(11)用1%的琼脂糖凝胶，电泳检测RNA质量。