[发明专利]风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法。本发明从15种优势菌中选取三种菌株，其中细菌、丝状真菌和放线菌个一种，将其培养后应用于草坪植物建植体系中。根据对这15种菌株作用分析，最终选定假单胞菌、木霉和链霉菌这三种。它们都能产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物的生长，还可以产生代谢物质或通过竞争作用来抑制或阻挠根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。

主权项

一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）材料的选择：城市污泥来自污水处理厂；（2）菌株的培养：称取污泥10g，放入盛有90 g无菌水的锥形瓶中加入玻璃珠，放在摇床上振摇20 min，采用稀释分离法制备10^－2、 10^－3、10^－4、10^－5、10^－6的污泥悬浮液； 根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先倒好的平板中；其中1）真菌用马丁氏琼脂平板，此培养液1000 ml加1%孟加拉红水溶液3.3 ml，临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0.3 ml;放线菌用高氏一号琼脂平板，临用时每100 ml培养基中加入10%苯酚2滴；细菌用牛肉膏蛋白胨平板；用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复3次，28℃培养；2）根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化，依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量；3）每种培养基上确定5种优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定；（3）菌种的鉴定1）将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18 － 24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，采用通用引物 27f/1492r27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ (SEQ ID NO:1);1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’ (SEQ ID NO:2);进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因，PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；    2)优势真菌的鉴定：将分离到的优势真菌接种到马丁氏培养基上，28℃ 培养 7 天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10 × 40 倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态，参照有关资料进行形态学鉴定；    3)挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，采用通用引物 通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’) (SEQ ID NO:3)和ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC ‑3’） (SEQ ID NO:4)进行 PCR 扩增 18SrDNA 基因，PCR 反应程序如下：94℃ 2min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min；扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较； 4)优势放线菌的鉴定将分离到的优势放线菌接种到高是一号培养基上，28℃ 培养 7‑10 天后，采用印片法观察放线菌形态, 将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18‑24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版,采用通用引物 27f/1492r27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ (SEQ ID NO:5);1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’ (SEQ ID NO:6)进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因,PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。