[发明专利]一种检测白细胞介素‑6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素‑6的方法

摘要

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种检测白细胞介素‑6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素‑6的方法。该试剂盒包括生物素化抗体、酶标记抗体、化学发光底物和亲和素偶联的超顺磁微粒；生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗白细胞介素‑6单克隆抗体A偶联的产物；酶标记抗体为酶与抗白细胞介素‑6单克隆抗体B偶联的产物。本发明提供的试剂盒具有检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，检测过程简单，并能方便用于全自动检测仪器等优点。

主权项

一种检测IL‑6的试剂盒，其特征在于，包括生物素化抗体工作液、酶标记抗体工作液、化学发光底物液和亲和素偶联的超顺磁微粒工作液；所述生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗IL‑6单克隆抗体A偶联的产物；所述酶标记抗体为酶与抗IL‑6单克隆抗体B偶联的产物；所述亲和素偶联的超顺磁微粒工作液由含0.2％酪蛋白和0.02％TW‑20的50mM PBS的溶液将亲和素偶联的超顺磁微粒稀释至0.25mg/mL获得；所述生物素化抗体工作液由含1％BSA的50mM PBS溶液将所述生物素化抗体稀释至2μg/mL获得；所述酶标记抗体工作液由含1％BSA和0.05％TW‑20的50mM PBS溶液将所述酶标记抗体稀释至0.5μg/mL获得；所述化学发光底物液、所述亲和素偶联的超顺磁微粒工作液、所述生物素化抗体工作液以及所述酶标记抗体工作液的体积用量比为100μL:50μL:50μL:50μL；所述亲和素偶联的超顺磁微粒由如下方法制备得到：取表面活性基团为羧基基团的直径为500nm～5μm的超顺磁微粒10mg，置于磁分离器上2min，弃去上清液；加入0.05mol/mL PBS缓冲液4mL，吹打均匀，置于磁分离器上分离2min，弃去上清液，重复洗涤2次；清洗完毕后，加入50mg/mL pH 7.0的EDC溶液1200μL活化超顺磁微粒，吹打均匀后，置于振荡器上，反应1h，获得活化后的超顺磁性微粒；然后加入亲和素为链霉亲和素蛋白进行偶联，具体操作为：链霉亲和素用10mmol PBS缓冲液溶解，向活化后的超顺磁性微粒中加入5mg/mL链霉亲和素溶液1500μL，置于振荡器上反应3～6h；偶联完成后，加入1％BSA3mL封闭磁微粒表面的剩余的羧基基团，混匀后，置于振荡器上反应30min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液5mL，混合均匀，置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤3次；最后加入含有0.5％BSA的0.1mol/mL PBS的保存液复溶，获得亲和素偶联的超顺磁微粒，亲和素偶联的超顺磁微粒的浓度为0.5～2mg/mL；所述生物素化抗体由如下制备方法得到：取生物素、N‑羟基丁二酰亚胺和二环己基碳二亚胺各1mmol，一并加入二甲基甲酰胺溶液6mL中，室温18～25℃搅拌18h，过滤，滤液减压抽干，干燥物反复用乙醚洗涤后复溶于异丙醇，再用真空抽干法使浓缩成原量一半体积，置于低温冰箱中结晶，滤纸过滤，收集结晶物，用乙醚洗后即得到生物素N羟基丁二酰亚胺酯；用0.1mol/L NaHCO3溶液将抗IL‑6单克隆抗体A稀释成2mg/mL的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的20mg/mL的生物素N羟基丁二酰亚胺酯20μL，混匀，于室温22℃反应1h，在4℃环境中置于0.1mM PBS缓冲液中透析24h，透析完成后收集的反应物即为生物素化抗体；所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记抗体，由如下方法制备得到：采用改进的过碘酸钠氧化法制备得到辣根过氧化物酶标记抗体：取辣根过氧化物酶20mg溶于蒸馏水1.5mL中，加入60mmol/L NaIO4 0.4mL，放置4℃，混合均匀，氧化60min，然后加入0.16mol/L乙二醇0.4mL，再置4℃终止30min；加入抗IL‑6单克隆抗体B 5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，加5mg/mL NaBH4 0.6mL，置4℃终止2h，加入与上述混合溶液等容积的饱和硫酸铵，4℃沉淀30min后用12000r/min离心15min；沉淀物用pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液1mL溶解，用PBS缓冲液透析除铵，完成后‑20℃保存，获得辣根过氧化物酶标记抗体；所述抗IL‑6单克隆抗体B识别IL‑6的抗原表位与所述抗IL‑6单克隆抗体A识别IL‑6的抗原表位不同。