[发明专利]镉离子胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用

摘要

镉离子胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用，本发明之镉离子胶体金免疫层析检测试纸条按照以下方法制备而成：（1）抗镉离子单抗的制备和纯化；（2）检测抗原镉-乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白的制备；（3）胶体金溶液的制备；（4）抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备；（5）喷金；（6）硝酸纤维素膜上包被C,T线；（7）镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装。本发明还包括所述镉离子胶体金免疫层析检测试纸条的应用。本发明之镉离子胶体金免疫层析检测试纸条，成本低廉，检测精度高，可大规模地对粮食及其加工产品残留重金属镉进行快速、方便、准确的检测。

主权项

 镉离子胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，按照以下方法制备而成： （1）抗镉离子单抗的制备和纯化：用双功能乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸螯合剂将镉离子偶联到牛血清蛋白上，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2‑4 ml腹水，加入相当于腹水体积1.8－2.2倍的醋酸钠缓冲液，调节pH到4.0‑5.0，得混合液；于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸与所述混合液的体积比为30‑40μl/ml；2‑8℃下静置、离心，得到上清液；调节pH到7.0‑7.8，2‑8℃冷水浴下加入硫酸铵，控制硫酸铵终浓度为0.25‑0.30g/ml，静置1‑2h；然后2‑8℃、8000‑12000r/min离心10‑20min，弃上清液，将沉淀溶于0.008‑0.012mol/L的磷酸盐缓冲溶液中进行透析，2‑8℃静置过夜，8000‑12000r/min离心10‑20min，弃沉淀；得到抗镉离子单抗；（2）检测抗原镉‑乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白的制备：取乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸以质量体积比为15－25mg/ml溶于二甲基亚砜中形成A液；将兔抗牛血清蛋白以质量体积比为15‑16mg/ml溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，分别加入占三羟甲基甲烷盐酸盐体积1‑2%的三乙胺和聚乙二醇600，形成B液；将A液逐滴加入B液中，所述Ａ液与Ｂ液体积比为1:0.8‑1.2，震荡12‑24h；用超滤管离心，得到乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白；取硝酸镉以质量体积比为10‑12mg/ml溶于二甲基亚砜中形成C液；将C液逐滴加入到乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白中，乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白与Ｃ液的体积比为1:0.8‑1.2，震荡2‑5h；用超滤管离心，得到检测抗原镉‑乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白；（3）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008‑0.012%的氯金酸水溶液80‑120ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8‑1.2%的柠檬酸三钠水溶液2‑3ml，继续搅拌加热0.5‑24h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20－40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；（4）抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备：取步骤（3）所得胶体金溶液80‑120ml，用摩尔浓度为0.2‑0.3mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.3‑8.8；将步骤（1）所得抗镉离子单抗1.2‑2.0mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5－24小时；逐滴加入质量浓度为8‑12%的无菌牛血清蛋白8‑14ml，搅拌0.5－24h，4℃－30℃静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000－14000r/min离心20‑60min，弃去上清液，加入摩尔浓度0.01‑0.02mol/L的磷酸盐缓冲液2‑6ml重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液；（5）喷金：把步骤（4）所得抗镉离子单抗标记的胶体金溶液按2－10μl/cm的喷量喷在结合垫上，37℃－45℃抽风烘干，时间为5－24h，得到喷金后的结合垫；  （6）硝酸纤维素膜上包被C,T线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2－1.5mg/ml；T线为检测线，包被镉的检测抗原镉‑乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白，浓度为0.1－0.9mg/ml；37℃－45℃抽风烘干，时间为2－24h；得到包被后的硝酸纤维素膜；所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端；   （7）镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤（5）所得喷金后的结合垫、步骤（6）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条；组装方式如下：以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡5－24h，取出后于37－45℃抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.01－0.02mol/L的磷酸盐缓冲液、质量体积比为3g－6g/（100ml磷酸盐缓冲液）的非离子表面活性剂、体积比为1ml－4ml/（100ml磷酸盐缓冲液）的吐温20和质量体积比为5g－20g/（100ml磷酸盐缓冲液）的聚乙二醇6000组成的，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0－7.5。