[发明专利]一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂

摘要

本发明公开了一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂，选取了与目的RNA cDNA大小相近的质粒作为竞争模板对基因拷贝数进行量化。选取不同的模板分别对fRNA和trRNA进行检测，具有通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，适于不同人群HBV RNA的检测，有望对HBV病毒各阶段的动力学进行更加全面的了解，完善传统检测项目。

主权项

一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作：1)第一轮扩增构建fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系：14.0μl H₂O，10.0μl来自待检测对象的核酸提取物，1.0μl竞争模板19L27，1.5μl浓度为100ng/μl的引物1434+，3.0μl浓度为100ng/μl的引物1806a，3.0μl浓度为100ng/μl的引物1808a，5.0μl浓度为10mM的dNTP，2.5μl浓度为100mM的DTT溶液,10.0μl5×RT/PCR buffer，1.0μl RNA聚合酶；所述的引物1434+为：TCTCATCTGCCGGACCGTGT；所述的引物1806a为：(T)15AGCTC；所述的引物1808a为：(T)15GAAGC；构建trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系：17.0μl H₂O，10.0μl来自待检测对象的核酸提取物，1.0μl竞争模板J166(16)，1.5μl浓度为100ng/μl的引物1445+，3.0μl浓度为100ng/μl的引物1683a,5.0μl浓度为10mM的dNTP，2.5μl浓度为100mM的DTT溶液,10.0μl5×RT/PCR buffer，1.0μl RNA聚合酶；所述的引物1445+为：GGACCGTGGCACTTCGCTT；所述的引物1683a为：(T)15CGTGG；将构建的fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系、trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增：50℃孵育20min；93℃变性1min40sec；DNA扩增为90℃40sec，53℃50sec，70℃40sec，35个循环；70℃15min后冷却至4℃；2)第二轮扩增构建fRNA第二轮反应体系：31.0μl H₂O；5.0μl第一轮fRNA扩增产物，0.75μl浓度为100ng/μl的引物1464+，0.75μl浓度为100ng/μl的引物1806a‑()，0.75μl浓度为100ng/μl的引物1808a‑，5.0μl浓度为10mM的dNTP，1.5μl浓度为50mM的MgCl₂溶液，5.0μl PCR buffer，0.25μl Taq DNA聚合酶；构建trRNA第二轮反应体系：31.75μl H₂O，5.0μl第一轮trRNA扩增产物，0.75μl浓度为100ng/μl的引物1464+，0.75μl浓度为100ng/μl的引物1683a，5.0μl浓度为10mM的dNTP，1.5μl浓度为50mM的MgCl₂溶液，5.0μl PCR buffer，0.25μl Taq DNA聚合酶；所述的引物1464+为：TCACCTCTGCACGTCGCATG；所述的引物1683a为：(T)15CGTGG；将构建的fRNA第二轮反应体系、trRNA第二轮反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增：93℃变性1min40sec；DNA扩增为90℃40sec，53℃50sec，70℃40sec，35个循环；70℃15min后冷却至4℃；3)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物在第二轮扩增完成之后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，同时添加一定浓度的竞争模板作为对照；比较扩增产物与竞争模板条带的信号值，如果两者信号值相当则表明待测对象中fRNA、trRNA的浓度与竞争模板的浓度相当；如果两者的信号值不相当，则增加或稀释琼脂糖凝胶电泳时竞争模板的浓度，直到两者信号值相当为至。