[发明专利]大黄鱼肝表达抗菌肽LEAP-2C在毕赤酵母中的胞内表达方法

摘要

本发明公开了大黄鱼肝表达抗菌肽LEAP-2C在毕赤酵母中的胞内表达方法，特点是包括大黄鱼LEAP-2C基因（登录号：KJ024789）的重组表达载体构建的步骤；多拷贝表达盒LEAP-2C/pAO815构建的步骤；酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115中，经蛋白测定和重组子筛选，获得重组工程菌株；最后经过摇瓶发酵扩大培养和甲醇诱导，实现重组大黄鱼LEAP-2C的胞内表达的步骤，优点是表达水平高、生产成本低及产量高，大黄鱼LEAP-2C酵母表达产品可应用于水产养殖饲料添加剂和抗菌新药中。

主权项

大黄鱼肝表达抗菌肽LEAP‑2C在毕赤酵母中的胞内表达方法，将大黄鱼LEAP‑2C基因插入胞外表达载体pAO815中构建多拷贝表达载体；酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115中，获得重组工程菌株；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组大黄鱼LEAP‑2C的胞内表达，其特征在于步骤如下：（1）构建重组表达质粒抽提大黄鱼肝组织mRNA，逆转录合成大黄鱼LEAP‑2C（登录号为 KJ024789），以此为模板设计引物进行PCR扩增大黄鱼LEAP‑2C蛋白的基因成熟肽区域 (Ser42‑Ser79)，将含大黄鱼LEAP‑2C基因的PCR扩增产物用限制性内切酶Eco RI单酶切，将酶切后的PCR 产物与用相同限制性内切酶Eco RI单酶切的的质粒pAO815用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α中，得到重组表达质粒LEAP‑2C/pAO815；（2）多拷贝表达盒LEAP‑2C/pAO815的构建将构建的重组质粒LEAP‑2C/pAO815经BglⅡ和BamHⅠ双酶切，获得基因片段AOX‑LEAP‑2C；同时将重组质粒LEAP‑2C/pAO815经B amHⅠ单酶切、碱性磷酸酶处理去磷酸化后，将酶切片段AOX‑LEAP‑2C插入到去磷酸化的LEAP‑2C/pAO815中，转化大肠杆菌（E. coli） DH5α后，用BglⅡ和BamHⅠ双酶切，获得重组质粒2拷贝表达盒2(AOX‑LEAP‑2C)/pAO815，重复上述方法，获得多拷贝表达盒重组质粒n(AOX‑LEAP‑2C) /pAO815；（3）毕赤酵母重组子的转化将多拷贝表达盒重组质粒n(AOX‑LEAP‑2C) /pAO815经Sa lⅠ酶切线性化后，将感受态毕赤酵母GS115 细胞与线性化的重组表达质粒n(AOX‑LEAP‑2C)/pAO815按16ul:1ug 比例混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子于30℃培养2 ~ 4 d，挑取生长较快的大菌落8个，经G418筛选及PCR 鉴定，阳性克隆为重组工程菌n(AOX‑LEAP‑2C) /pAO815‑GS115；将获得的重组工程菌株n(AOX‑LEAP‑2C) /pAO815‑GS115接种于BMGY 培养基中，培养至OD600 达2.0‑6.0 收集细胞，重悬于BMMY 培养基中，每隔24 h加入甲醇至终浓度1.0%诱导表达；（4）LEAP‑2C的蛋白测定和重组子筛选收集不同培养时间点的重组工程菌株n(AOX‑LEAP‑2C) /pAO815‑GS115悬液，超声破碎后获得重组大黄鱼LEAP‑2C酵母蛋白样品，用ELISA检测重组大黄鱼LEAP‑2C酵母蛋白样品中大黄鱼LEAP‑2C的蛋白含量，筛选LEAP‑2C蛋白表达含量最高的菌株，获得高表达重组工程菌株；（5）高表达酵母菌株扩大培养将高表达重组工程菌株接种于 BMGY 培养基生长，30 ℃培养22‑26h直至OD600 达2.0‑4.0，1500rpm 离心5 min 收集菌体，然后将菌体按5‑20wt%接种量转入BMMY 培养基中进行甲醇诱导表达，在pH 5.4‑7.0的条件下，30℃继续培养96 小时，每24 h补加一次甲醇至甲醇终浓度0.5‑5%，使毕赤酵母胞内表达大黄鱼LEAP‑2C蛋白，获得重组大黄鱼LEAP‑2C蛋白的发酵产物。