[发明专利]一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-DE图谱的构建

摘要

本发明提供的一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2-DE图谱的构建,通过构建细毛羊毛囊蛋白质的双向电泳体系，从蛋白质水平上筛选与羊毛细度相关的蛋白质，较为直接和全面的发现相关蛋白在不同纤维直径的细毛羊皮肤组织毛囊中的表达和调控规律，进而可以通过鉴定蛋白质的功能与属性推测出相关的候选基因，对于细毛羊的遗传繁育具有重要意义，为后期的细毛羊毛囊蛋白的蛋白质组学分析奠定基础。

主权项

 一种细毛羊皮肤组织中毛囊蛋白质2‑DE图谱的构建，其特征在于：分步实施；样品制备：称取细毛与毛囊的样品0.4‑0.5g，放入灭菌的研钵中用液氮研磨，研磨后用TCA法处理，用Bradford法定量；双向电泳:设计每根胶条的上样量为100μL，选择18 cm、pH 4‑7的线性IPG胶条；1）等电聚焦水化结束，在移至聚焦盘中的胶条两头，加2.8‑3.2mL矿物油并固定电极板，打开聚焦仪，设置胶条数目与电聚焦程序；2）平衡等电聚焦结束，将 IPG 胶条取出，用 MilliQ 水湿的滤纸吸干表面矿物油及多余样品，放入平衡液A中平衡15min,结束后，冲洗胶条上的平衡液A，再转入B平衡液中，平衡15 min；平衡时先将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解;在二次平衡后将胶条浸没在电泳缓冲液中,即可取出，防止蛋白质损失；配制电泳缓冲液：取18.00g Tris、86.40g 甘氨酸、6.00g SDS，溶于5 LMilliQ水中，充分混匀，定容至 6 L；配制低熔点琼脂糖封胶液：取0.50g低熔点琼脂糖、0. 30g Tris、1.44g 甘氨酸、10% SDS 1mL、溴酚蓝储存液100μL，用MilliQ 水定容至 100mL，加热溶解至澄清，室温保存；其中溴酚蓝储存液：取0.1g溴酚蓝、60mg Tris‑base，用MilliQ水定容至10mL；配制胶条平衡缓冲液A：取10mL胶条平衡缓冲液母液，室温溶解，加入 0.20g DTT，充分混匀使用;配制胶条平衡缓冲液B：取10mL胶条平衡缓冲液母液，室温溶解，加入0.25g 碘代乙酰胺，充分混匀使用;其中胶条平衡缓冲液母液：取36.00g 尿素、2.00g SDS、 pH8.8、 1.5mol/L  Tris‑HCl 25mL，20mL丙三醇、用MilliQ 水定容至 100mL，分装在10mL管内，‑20℃保存；3）SDS‑PAGE垂直电泳制好凝胶，用移液枪吸取饱和正丁醇1‑2mL加在 SDS‑PAGE 凝胶顶端上；将玻璃板拆开，用 MilliQ 水冲洗胶面，放在胶板架上，加低熔点琼脂糖封胶液1‑2mL，将胶条一端压入玻璃板夹层中与 SDS‑PAGE 凝胶之间无空隙，再用低熔点琼脂糖封胶液封住胶条；4）凝胶染色采用硝酸银染色法的染色试剂：配制丙烯酰胺单体储存液：取30g Acr、0.8g Bis，溶于 400mL MilliQ 水中，定容至 500mL，用0.45μm 的微孔滤膜过滤后，4℃避光保存；配制12%丙烯酰胺凝胶液40 mL/块：取49.5mL MilliQ 水、60mL丙烯酰胺单体储存液、37.5mL Tris‑HCL、pH8.8，1.5mL 10%SDS、0.15gAp溶于1.5mlMilliQ 水中，25.5μL TEMED溶于225μL MilliQ 水中；    5）图象的扫描与分析应用ImageMaster 2D platinum软件对两岁的不同细型的细毛羊的2‑DE凝胶图谱进行分析，检测出表达丰度上在2倍以上的35个差异蛋白。