[发明专利]黄瓜离体叶绿体电转化方法

摘要

本发明涉及黄瓜离体叶绿体电转化方法。以黄瓜(Cucumis sativum)无菌子叶分离的叶绿体为材料，建立了在适宜体积和叶绿体浓度与表达载体比例下的黄瓜离体叶绿体电转化体系。转化后叶绿体经短时孵育、离心、DNase I消化后进行裂解，以提取的转化叶绿体DNA和RNA为模板进行PCR和RT-PCT鉴定，结果证明，叶绿体表达载体不仅能高效转入离体叶绿体中，而且在转录水平能检测到外源基因的表达。本发明克服了高等植物细胞内叶绿体转化周期长、技术难和成本高等难题，为高等植物叶绿体转化载体构建和关键元件的功能鉴定以及叶绿体基因表达调控和细胞工程等基础理论与应用研究提供了有效的新途径。

主权项

黄瓜离体叶绿体电转化方法，其特征在于该方法的具体步骤包括：第1、黄瓜离体叶绿体电转化与孵育：第1.1、4℃和无菌条件下，将新鲜提取的黄瓜叶绿体进行离心1000g/8～10min，用0.3M～0.33M山梨醇溶液重悬叶绿体沉淀后再次离心，重复这样的洗涤3～4次；第1.2、最后用0.3M～0.33M山梨醇溶液重悬叶绿体，并控制叶绿体悬液浓度为5～6×10⁶/mL，冰浴；第1.3、取150ul叶绿体溶液至离心管中，加入1ug转化质粒即叶绿体表达载体，混匀后转入预冷的电转化杯中，以13kV/cm电压电击；电击后迅速向电转化杯中加入叶绿体孵育液，轻轻混匀后转移到离心管中，以150rpm/min和25℃下避光孵育20分钟，转4℃避光过夜；第2、黄瓜离体叶绿体电转化后PCR鉴定：第2.1、4℃下以1000g/8～10min离心收集经电转化和孵育的叶绿体，用1ml叶绿体孵育液重悬叶绿体，然后再离心，重复2次这样的洗涤；第2.2、取84ul孵育液重悬叶绿体，加入6ul DNaseI和10ul Buffer，25℃消化2h；加入0.5M EDTA4ul至终浓度为20mM，65℃水浴20min，终止DNase I反应；第2.3、4℃下1000g/8～10min离心收集叶绿体，用0.3M～0.33M山梨醇洗叶绿体沉淀2～3次，取部分上清作为模板进行PCR，检测叶绿体外是否残留转化质粒；第2.4、向叶绿体沉淀中加入400ul裂解液，65℃水浴20min；加入200ul5M KAc，pH7.0，冰浴25～30min；4℃下12000rpm离心，取上清并加入200ul Tris‑酚和200ul氯仿/异戊醇为24：1的混合液，振荡后12000rpm离心，取上清；加入1/10V3M NaAc和2.5V无水乙醇，‑20℃冰箱过夜沉淀核酸；次日12000rpm离心15min，弃上清；70％乙醇洗沉淀2次，37℃温箱烘干后用含RNase的ddH₂O溶解叶绿体DNA沉淀；第2.5、以提取的叶绿体DNA为模板，依据第1步中叶绿体表达载体上的外源基因序列设计引物，以20μL总体系和35个循环进行PCR；第3、黄瓜离体叶绿体电转化后RT‑PCR鉴定：第3.1、在4℃下，以1000g/8～10min离心收集经电转化和孵育的叶绿体，用1ml叶绿体孵育液重悬叶绿体，然后再离心，重复2次这样的洗涤；取150ul孵育液重悬叶绿体，加入等体积叶绿体裂解液混合均匀，65℃处理5min；加入2M的KCl40μl，混合均匀后置于冰上10‑20min；第3.2、4℃下12000rpm离心10min，取上清于新管中，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇为25:24:1的混合液混匀，冰浴30min；4℃下12000rpm离心10min，取上清于新管中，加入等体积氯仿：异戊醇为24:1的混合液，冰浴30min；4℃下12000rpm离心10min，取上清于新管中，加入1/3体积的8mol/L的LiCl，4℃过夜；第3.3、4℃下12000rpm10min，弃上清，室温下干燥15min；在冰上分别加入40μl DEPC‑ddH₂O、4μl3mol/L NaAC，pH6.0,和110μl的无水乙醇，混匀后，‑20℃过夜；4℃12000rpm10min，弃上清，室温下干燥15min；用DEPC‑ddH₂O溶解RNA沉淀；第3.4、取71μl RNA溶液，加入0.5μl DNase I‑RNase free、8μl DNase I buffer和0.5μl RNase抑制剂，37℃水浴中温育40min；向体系中加入120μl ddH₂O、100μl氯仿：异戊醇为24:1的混合液和100μl水饱和酚，混匀后在4℃下12000rpm下离心10min；将离心后分层的液体中上层清夜取出至另一EP管，加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后，在‑20℃下静置超过4h；第3.5、在4℃和12000rpm下离心15min后弃去上清，加入1ml70％乙醇轻轻清洗沉淀，然后在4℃和12000rpm下离心10min；弃上清，风干后溶解于20μl ddH₂O中；第3.6、以上述第3.5步提取的叶绿体RNA为模板，使用大连宝生物工程有限公司的反转录试剂盒cDNA Synthesis Kit M‑MLV version转录合成cDNA，再以该cDNA为模板、以转化载体上外源序列为引物用Taq酶进行PCR；为了检测经DNase I消化后RNA中是否残留了转化质粒DNA，以转化组叶绿体RNA为模板，以转化载体上外源序列为引物用Taq酶进行PCR，以此作为负对照。