[发明专利]一种牙周组织特异性细胞外基质ECM的制备方法及其应用

摘要

一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：1）人牙周膜细胞的分离与培养；2）牙周组织特异性ECM的制备；牙周组织特异性细胞外基质的应用，牙周组织特异性ECM作为体外扩增人牙周膜干细胞的应用；并促进其定向分化；具有制备方法简单、能显著促进牙周膜干细胞的体外增殖和定向分化的特点。

主权项

一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）人牙周膜细胞的分离与培养，具体做法是：收集临床上12～29岁因正畸需要拔除的新鲜恒双尖牙和第三磨牙，牙周健康、无龋坏、无根尖炎症，在超净工作台中用75%的酒精消毒牙冠，PBS液漂洗3～5次，刮取根中1/3牙周膜，移入离心管，加入625units/ml的I型胶原酶和2.4units/mlDispase轻轻震荡，37℃培养箱内消化40min，每隔5min振荡1次，离心转速1200r/min，离心5min，弃去上清液；加入0．5～1mL含15%胎牛血清的α—MEM培养液，移入25mL培养瓶底壁，均匀接种，把培养瓶置入37℃、5%CO₂饱和湿度的孵箱中孵育24h，细胞贴壁后轻轻加入培养液至3mL；3d后更换培养液弃去未贴壁细胞，以后每隔2～3d换液1次，收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用，细胞生长达8O%～90%汇合时用0．25％胰蛋白酶消化，以1：2比例传代；2）牙周组织特异性ECM的制备，具体做法是：将P3代人牙周膜细胞hPDLCs以2x10⁴cells/ml的密度接种于6孔板中，培养15天，每3‑4天换液一次，最后8天换成膜诱导液，PBS液冲洗2遍，加入脱细胞处理液，室温下反应5分钟，PBS液冲洗3遍，获得hPDLCs‑ECM，附着于6孔板，4°C低温保存。