[发明专利]用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法

摘要

一种番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由番茄prosystemin基因克隆、构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体、制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株步骤组成。将番茄prosystemin基因转入丹参植株，干涉了丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，抗虫性明显高于野生丹参，生长100天转基因的丹参根中，迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA含量，分别是同时期非转化丹参根中迷迭香酸和丹酚酸B和丹参酮IIA的1.31倍、1.69倍、2.62倍。

主权项

一种用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由下述步骤组成：(1)番茄prosystemin基因克隆用E.Z.N.A.^TM Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番茄总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒，按照说明书将番茄总RNA反转录成cDNA备用；采用Primer Premier5.0软件，设计番茄prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为：取番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、上游引物、下游引物、二次蒸馏水的体积比为1：0.5：5：5：1：1：37.5，按照如下条件反应：95℃3分钟，95℃30秒、57℃30秒、72℃45秒、循环35次，得到番茄prosystemin基因，并在番茄prosystemin基因的上游引物前引入Spe I限制性酶切位点和保护碱基GACTAGT，在下游引物前引入BstE II限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，用番茄prosystemin基因引物：上游引物prosystemin‑F5′‑GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC‑3′下游引物prosystemin‑R5′‑CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG‑3′以番茄cDNA为模板，按下述反应体系进行混合：番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、prosystemin‑F、prosystemin‑R、二次蒸馏水的体积比为2：0.5：5：5：1：1：36.5，并按照95℃3分钟，95℃30秒、57℃30秒、72℃45秒、循环35次，进行聚合酶链式反应扩增，得含有酶切位点的番茄prosystemin基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19‑T载体用T4DNA连接酶按连接酶使用说明书连接，构成prosystemin‑pMD19‑T载体，并采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，prosystemin‑pMD19‑T载体与大肠杆菌DH5α的体积比为1：9.5～10.5，挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番茄prosystemin基因序列，该基因序列如下：(2)构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰‑O‑甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体用Spe I和BstE II分别双酶切prosystemin‑pMD19‑T载体、植物表达载体pCAMBIA‑1302，分别回收prosystemin基因片段和pCAMBIA‑1302双酶切后的酶切产物，将片段与产物用T4DNA连接酶连接，筛选，获得pCAMBIA‑1302‑prosystemin中间载体；选取位于丹参咖啡酰‑O‑甲基转移酶基因，简称COMT，编码区3′端345bp的片段作为RNA干涉的靶片段，在该片段分别引入酶切位点Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I，应用Primer Prime5.0设计扩增引物：iCOMT‑F：5′‑CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA‑3′iCOMT‑R：5′‑GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT‑3′；用聚合酶链式扩增反应，将该345bp的上游引入Cla I和Kpn I两个酶切位点，于其下游引入Xho I和BamH I两个酶切位点；经聚合酶链式扩增反应扩增，得含有Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I的产物COMTi，连接p‑MD19T载体得COMTi‑pMD19T载体；用Xho I和Kpn I分别酶切COMTi‑pMD19T载体、pKannibal载体，将用Xho I、KpnI酶切COMTi‑pMD19T载体的片段与经Xho I、Kpn I酶切pKannibal载体的片段，用DNA连接酶相连成pKannibal+中间载体；用BamH I和Cla I分别酶切COMTi‑pMD19T载体、pKannibal+载体，用含有BamH I和Cla I酶切COMTi‑pMD19T载体的片段与经BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA连接酶相连，获得的新载体为pKANNIBAL/COMTi；用Sac I和Pst I双酶切pKANNIBAL/COMTi、pCAMBIA1302‑prosystemin载体，将双酶切pKANNIBAL/COMTi所获得的干涉转录框，连接到经双酶切后的pCAMBIA1302‑prosystemin载体上，得pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi载体，并转入大肠杆菌DH5α中进行扩增，提取质粒，用酶切方法进行鉴定，得到含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰‑O‑甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi，命名为pCPKC载体；(3)制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰‑O‑甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于27.5℃～28.5℃培养箱中倒置培养36～72小时，挑取抗性单菌落分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin‑F和prosystemin基因特异性引物prosystemin‑R进行聚合酶链式反应，筛选，用pCPKC载体上特异性引物，序列为：35S‑F5′‑TACAAAGGCGGCAACAAACG‑3′35S‑R5′‑GCAATGGAATCCGAGGAGGT‑3′进行聚合酶链式反应，筛选，获得含有pCPKC载体的根癌农杆菌菌株；(4)制备转基因丹参植株采用常规组织培养方法获得无菌丹参试管苗，采用叶盘转化法，将含有pCPKC载体的根癌农杆菌与无菌丹参试管苗进行浸染，获得含有番茄prosystemin基因并且干涉丹参内源咖啡酰‑O‑甲基转移酶基因的丹参植株。