[发明专利]利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法

摘要

本发明公开了一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，该方法包括以下步骤：1）分离SKPs；2)将分离得到的SKPs移入扩增培养基中进行扩增；3)SKPs的DiI荧光染料标记；4）制备组织工程皮肤，将胶原海绵打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵Co60照射灭菌，SKPs细胞1×105个/20—30uL培养基加于海绵糙面上，进行培养。本发明的组织工程皮肤中的SKPs可分化为平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经组织，分化出的平滑肌细胞、血管内皮细胞可参与构成血管结构，促进创口新生血管形成，从而提高皮肤愈合速度及愈合质量。

主权项

一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，包括以下步骤 ：1)、分离 SKPs将皮肤样品放入无菌PB中，显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4℃消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分，保留真皮层组织；加入胶原酶37℃消化1h；吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次； 2)、SKPs 快速扩增当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在扩增培养基中扩增培养；3)、SKPs的DiI荧光染料标记细胞悬液37℃培养箱中孵育5min后，与中浓度为3ug/ml DiI荧光染料孵育8min；后用PBS洗3次，清除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4℃保存；4)、制备组织工程皮肤胶原海绵预处理打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵，放入0.01M PBS中，排气；Co60照射灭菌，照射量20K；超净台内铺板，紫外照射0.5h； 每孔300ul培养基，37℃培养箱中过夜；将海绵转移至另一孔板中；细胞1×105个/20—30uL培养基加于海绵糙面；37℃培养箱中孵育4h，细胞贴壁；4h后，培养基200—300uL/孔加入，37℃培养箱中孵育； 1天后，换液一次，从海绵边缘吸液，接种细胞3天后移植。