[发明专利]利用药物松胞素B检测淋巴细胞增殖的方法

摘要

本发明属于生物检测技术领域，具体为一种利用药物松胞素B检测淋巴细胞增殖的方法。本发明依据的原理：药物松胞素B可以阻滞细胞的分裂而不阻滞细胞核的分裂，从而使发生增殖反应的细胞经松胞素B处理后形成直观的双核细胞；外周血淋巴细胞在植物血凝素的刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖，而电离辐射可以抑制淋巴细胞的增殖。以2Gyγ射线照射人外周血，并以PHA刺激后再加入松胞素B处理，检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异。经PHA刺激后的淋巴细胞会形成双核细胞，而受照射淋巴细胞的双核率显著下降，表明利用松胞素B检测淋巴细胞双核率可以很好地反映淋巴细胞的增殖水平。本发明方法检测指标直观、操作简单、快速、经济、结果准确。

主权项

 一种利用药物松胞素B检测淋巴细胞增殖的方法，其特征在于具体步骤为：（1）取若干份健康人外周血，每份血分成照射组即增殖抑制组和非照射组；（2）血样用含PHA营养液培养：无菌操作将0.2‑0.6ml血样加入含有PHA营养液小瓶内，PHA终浓度为30‑70μg/ml，混匀后，置于温箱中培养1‑2天；（3）加入松胞素B继续培养：在含PHA营养液中培养结束后，向培养液内加入松胞素B，终浓度为2‑6μg/ml，温箱中继续培养24‑36h；（4）溶解红细胞：培养结束后，吸弃上清液，加入预温的质量浓度为0.87% NH₄Cl溶液3‑5ml，置于温箱中孵育10‑15min；（5）低渗处理：离心弃上清后每管细胞加入5‑10ml 0.075M KCl混匀，室温低渗10‑20min；（6）固定液固定：采用两步固定法，低渗后加入固定液固定，按体积比，固定液：低渗液=1：5‑8，滴管混匀后立即离心，弃上清每管加入5‑8ml固定液固定20‑30min；所述固定液为甲醇和冰醋酸的混和液，两者质量比为甲醇：冰醋酸=7‑9：1；（7）检测照射与非照射淋巴细胞的双核率的差异，双核率=双核细胞数/N，N为观察淋巴细胞个数，N取500—1000；上述步骤中，所述温箱温度为36℃‑40℃，所述预温温度为36℃‑40℃。