[发明专利]制备抗人R47H-TREM2突变体的人单克隆抗体的方法

摘要

本发明提出了一种制备抗人R47H-TREM2突变体的人单克隆抗体的方法，包括步骤：1)多肽抗原的合成；人工合成201条6～15aa R47H-TREM2多肽，使抗原决定族围绕TREM2基因突变靶点，并以TREM2的R47为中心向两边扩展，每条多肽序列错开1～2个aa；然后HPLC C-18反向柱纯化并冷冻干燥；2)制备R47H-TREM2突变体多肽抗原阵列Peptide Array；3)CD22+B细胞的采集；4)细胞培养；5)B细胞永生化；6)用R47H-TREM2突变体多肽抗原列阵筛选B-细胞阳性单克隆；本发明利用了永生化B细胞技术制备人单克隆抗体，对阿尔茨海默氏病(AD)患者具有重要的早期临床诊断和治疗潜力。

主权项

制备抗人R47H‑TREM2突变体的人单克隆抗体的方法，其特征在于，包括步骤： 1)多肽抗原的合成 人工合成201条6～15aa R47H‑TREM2多肽，使抗原决定族围绕TREM2基因突变靶点，并以TREM2的R47为中心向两边扩展，每条多肽序列错开1～2个aa；然后HPLC C‑18反向柱纯化并冷冻干燥； 2)制备R47H‑TREM2突变体多肽抗原阵列Peptide Array 使用96或184孔ELISA板，用包被缓冲液0.05mol/L碳酸盐缓冲液，将多肽抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜，次日洗涤3次并用湿盒4C保存； 3)CD22+B细胞的采集 收集60‑80岁健康老年人和AD患者外周血，15mL/人，并用Ficoll Hypaque试剂Sigma进行密度梯度离心以分离单核细胞Peripheral blood mononuclear cells，然后用PE‑Cy5‑labelled anti‑CD22抗体标记细胞并用流式细胞仪FACS(BD Biosciences)进行细胞分类，筛选出IgG+CD22+的B细胞； 4)细胞培养 在U‑形底的96孔细胞培养板中，用RPMI1640培养基Life Technologies培养筛选出的IgG+CD22+B细胞，50cells/well； 5)B细胞永生化 细胞培养两周内加放射性(83Gy)照射过的自体来源的滋养细胞1x10⁵/well，30％体积的EB病毒培养液及1ug/ml的HL多肽，再用1ug/ml的HL多肽加50U/ml IL‑2重复刺激7天，继续培养到28天后，收集各孔上清并用斑点印迹法(Dot Blotting)检测、挑选产生抗人R47H‑TREM2突变体的B‑细胞阳性克隆； 6)用R47H‑TREM2突变体多肽抗原列阵筛选B‑细胞阳性单克隆。