[发明专利]利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法及应用

摘要

本发明公开一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法及应用。该方法以嗜热厌氧梭菌初级脚手架蛋白基因设计引物；设计引物对A和引物对B；使用引物A扩增得到的cipA与线性化的质粒载体连接，得到阳性质粒，用作阳性对照并与引物对B结合起来制作标准曲线，横坐标为不同模板拷贝数的对数，纵坐标为荧光定量PCR反应出现荧光信号的初始循环数Ct；抽提待测样品中嗜热厌氧梭菌的基因组，使用引物对B进行荧光定量PCR，根据标准曲线得到待测样品中的cipA基因片段拷贝浓度，即为嗜热厌氧梭菌菌体数量。该方法用于检测嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中的生长情况，与传统方法相比，准确度高，特异性强，且操作简便。

主权项

一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计引物：根据GenBank中已报道的嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)初级脚手架蛋白基因cipA序列设计引物；设计用于扩增目的基因cipA的引物对A和用于荧光定量PCR的引物对B；(2)质粒标准品的建立：①基因组提取：从嗜热厌氧梭菌提取基因组；②目的基因cipA的扩增：以基因组为模板，以引物对A为PCR引物，进行PCR，得到目的基因cipA；③阳性质粒的构建：将步骤②得到的目的基因cipA与线性化的质粒载体连接，转化入宿主细胞中进行复制，筛选鉴定，得到阳性质粒；(3)标准曲线的建立：①质粒标准品中cipA基因片段拷贝数的测定：使用紫外分光光度计测定阳性质粒浓度，根据测定的核酸浓度，通过以下公式计算质粒标准品中cipA基因片段拷贝数：拷贝数/μL＝[(ng数×10‑9)×(6.02×1023)]÷(碱基数×345)；碱基数为阳性质粒的碱基数；②标准曲线的制作：将已测定浓度的阳性质粒进行梯度稀释，进行荧光定量PCR，所用的引物为引物对B；以不同模板拷贝数的对数为横坐标，以荧光定量PCR反应出现荧光信号的初始循环数Ct为纵坐标，绘制标准曲线；(4)检测待测样品中的嗜热厌氧梭菌数量：①抽提待测样品中嗜热厌氧梭菌的基因组；②按步骤(3)②进行荧光定量PCR，其中设置阴性对照和阳性对照，阴性对照中用水代替模板，阳性对照中的模板为步骤(2)制备的阳性质粒；③将待测样品的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待测样品中的cipA基因片段拷贝浓度，计算出的cipA基因片段的初始拷贝数即为嗜热厌氧梭菌菌体数量；步骤(1)中所述的引物对A为引物cipA(Ord)‑F和引物cipA(Ord)‑R；cipA(Ord)‑F：5’‑GGAATTCTACAACAGCAATCC‑3’；cipA(Ord)‑R：5’‑ATTGGATCATCTGACGGCGGT‑3’；步骤(1)中所述的引物对B为引物cipA(Q1)‑F和引物cipA(Q1)‑R：cipA(Q1)‑F：5’‑GTAACGGCAGCTACAACGGAAT‑3’；cipA(Q1)‑R：5’‑CTTTACCCCATACAAGAACACC‑3’。