[发明专利]一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法

摘要

本发明公开了一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，通过Solexa高通量测序技术鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA，并通过生物信息学相关技术进一步分析microRNA相关靶基因的功能及其作用的信号通路，整合microRNA本身及其靶基因的信息，筛选出与肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA。选择肠炎沙门氏菌感染后第7天这一时间点，作为样品采集点；对处理组和对照组中多个个体进行混池测序，每个组内的混池≥3；首次大规模分析鉴定与鸡肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA，将为深入研究microRNA在肠炎沙门氏菌感染中的作用机制奠定基础，为鸡的分子抗病遗传育种提供理论基础和科学依据。

主权项

一种鸡肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将白来航蛋鸡分为试验组与对照组，试验组接种肠炎沙门氏菌，对照组接种磷酸盐缓冲液，接种后第7天采集肠道组织样品，用试剂盒提取总RNA；2)试验组随机选取6‑9个个体，混池建3个库：Tp1，Tp2，Tp3，对照组随机选取5‑6个个体，混池建3个库：Cp1，Cp2，Cp3；3)采用Illumina Hiseq2000测序平台的单端50bp测序模式对样本进行高通量测序；4)测序原始数据经引物与接头序列去除，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段用于后续分析；5)统计microRNA的种类及数量，并对microRNA做长度分布统计；6)参考基因组比对将样本预处理后的干净数据读数与参考基因组序列比对，已知microRNA前体及成熟体比对统计信息；7)Rfam数据库比对选取Rfam10.1数据库来注释测序得到的microRNA序列，尽可能的发现并去除其中可能的核糖体RNA，胞质microRNA，核仁microRNA，核内RNA，转运RNA；8)microRNA表达量计算非编码microRNA表达量计算是将与参考基因组序列匹配的干净读数，采用cufflink软件，并通过统计学方法计算每条microRNA表达量，microRNA表达量计算采用FPKM计算度量指标，计算microRNA区间内microRNA表达量；9)microRNA差异表达分析及预测新microRNA10)microRNA靶基因预测针对差异表达分析得到的microRNA，利用miRanda算法预测来自比对组所得到的差异microRNA的靶基因，miRanda算法从(1)microRNA‑3′非翻译区序列匹配与(2)能量稳定性评估计算的二部计算预测步骤综合预测microRNA的靶基因；11)microRNA靶基因基因本体功能分析基因本体功能聚类常用于对目标组基因特征进行功能注释与分类，即差异表达microRNA的预测靶基因的功能聚类分析，采用基因本体注释系统，针对高度可信度靶基因预测结果展开分析，富集度分析采用超几何分布算法，并采用多重假设检验校验超几何分布统计量的P值，获得校正后P值，即Q值；12)microRNA靶基因生物通路功能分析生物通路分析采用京都基因与基因组百科全书数据库进行富集度分析；13)肠炎沙门氏菌感染相关microRNA的鉴定整合microRNA本身结果与其靶基因功能分析结果，获得鸡与肠炎沙门氏菌感染相关的microRNA。