[发明专利]筛选抗分解代谢产物阻遏效应的产纤维素酶高效突变子的方法

摘要

本发明公开了筛选抗分解代谢产物阻遏效应的产纤维素酶高效突变子的方法，(1)筛选培养基、验证培养基及摇瓶培养基的制备；(2)通过菌种诱变并对突变子进行初步筛选；(3)通过摇瓶发酵实验对突变子进行确认及多次验证。本发明方法有效筛选出抗分解代谢产物阻遏的木霉、青霉及曲霉高效产酶突变子，使真菌发酵产纤维素酶的过程中对葡萄糖等易利用碳源的限制解除，发酵可以通过添加葡萄糖作为能源加快发酵过程并提高发酵酶活，可有效的提高木霉、青霉及曲霉等纤维素酶生产菌株发酵产酶效率并降低成本。

主权项

筛选抗分解代谢产物阻遏效应的产纤维素酶高效突变子的方法，其特征是该方法包括以下步骤：  （1）培养基的制备筛选培养基成分如下（100mL体系）：预处理水稻秸秆粉末1%； KH₂PO₄ 0.2%；（NH₄）₂SO₄ 0.3%；刚果红0.1%；琼脂粉2%；2‑去氧基葡萄糖50ppm（w/v）；摇瓶培养基成分如下（100mL体系）：预处理水稻秸秆2%；KH₂PO₄ 0.2%；（NH₄）₂SO₄ 0.3%；验证培养基成分如下（100mL体系）：预处理水稻秸秆2%；KH₂PO₄ 0.2%；（NH₄）₂SO₄ 0.3%；2‑去氧基葡萄糖0.05 %(w/v)；水稻秸秆预处理方法：将自然风干的水稻秸秆置于1.2‑2Mpa的高压蒸气中处理5‑10min，再将其用自来水冲洗2‑4次，随后置于60℃烘箱中过夜；2‑去氧基葡萄糖灭菌方法：以蒸馏水为溶剂制备质量浓度0.1%的2‑去氧基葡萄糖母液，于115℃下灭菌30min，随后将灭过菌的母液加入灭过菌的筛选培养基中使其最终浓度达到50ppm（w/v），将灭过菌的母液加入到灭过菌的验证培养基中使其最终浓度达到0.05%（w/v）；（2）抗分解代谢产物阻遏突变子的初步筛选：将提前制备好的真菌孢子悬液置于30℃恒温摇床内培养30min，以提高休眠孢子成活率，之后进行菌种诱变（物理诱变、化学诱变），使孢子致死率达70%‑90%，随后均匀涂布于筛选培养基表面，置于30℃恒温箱中避光培养；将原始菌株的孢子涂布筛选平板作为对照；避光培养70‑80h后，观察并记录筛选培养基中的菌落形态，挑选直径大于对照组原始菌株单菌落30%，且菌落直径与产孢区直径比值大于2的单菌落，将其作为待确认突变子；（3）突变子的确认及验证：将步骤2中筛选出的突变子转接至3ml PDB试管中（2个重复）；30℃恒温摇床内培养24h，随后将其分别接种于验证培养基和摇瓶培养基中，160 rpm转速下 30℃恒温培养；将其原始菌株作为对照做以上相同处理；于发酵开始后120h‑180h取发酵液样品1ml，离心取上清液；通过国标法测定上清液的纤维素酶的滤纸片酶活（FPU）；若在摇瓶培养基中突变子的FPU酶活大于原始菌株FPU的120%；并且该突变子在验证培养基的FPU酶活大于其在摇瓶培养基的90%，则初步断定该突变子为正突变子；之后重复（3）中上述步骤三次，若结果一致，则确定该突变子为抗分解代谢产物阻遏高效产酶突变子。