[发明专利]菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法

摘要

本发明提供一种菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法，包括以下步骤：材料获得、茎尖剥取、蔗糖预培养、装载液装载、PVS2玻璃化保护液脱水处理、超低温冷冻保存、解冻洗涤和恢复再生培养步骤。采用本发明的小滴玻璃化法超低温保存技术，超低温保存后的菊芋试管苗离体茎尖经过化冻处理，恢复培养后直接再生成苗。表明该方法是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存菊芋种质资源的方法，存活率可达90％以上，再生率可达80％以上，再生植株恢复生长良好。

主权项

1.菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法，其特征在于，包括以下步骤：材料获得、茎尖剥取、蔗糖预培养、装载液装载、PVS2玻璃化保护液脱水处理、超低温冷冻保存、解冻洗涤和恢复再生培养步骤；具体如下：1)材料获得：①将菊芋块茎种植到花盆中，待生长到40cm，剪下生长健壮的枝条作为外植体，将其剪成3cm的带芽茎段，自来水冲洗表面污渍，用10％NaClO溶液表面消毒8min，无菌水冲洗3～5次后，将外植体接种到MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂培养基中进行培养；②试管苗生长稳定后转入MS+0.1mg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基中进行扩繁培养；培养温度为20±1℃，光照14h/d，光照强度2000～3000lux；2)茎尖剥取：经试管苗培养，选取生长4～5周的健康植株，在无菌条件下，用剪刀剪取带顶芽的茎段，去除包裹在外面的大叶片，然后在双目显微镜下用剪刀和解剖针剥去小叶片，切取大小2～3mm，带2个叶原基的茎尖；3)蔗糖预培养：将剥离下来的茎尖放入含有0.4M蔗糖的液体MS培养基的小烧杯中，然后将其置于摇床中暗培养3d；预培养温度为25℃，摇床转速60rpm；4)装载液装载：将预培养后的离体茎尖置于装载液中于25℃装载30min；其中装载液的配方为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖；5)PVS2玻璃化保护液脱水处理：将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃下处理15min；其中PVS2玻璃化保护液的配方为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖；6)超低温冷冻保存：将经PVS2玻璃化保护液脱水处理后的茎尖，放入含有20μl新鲜PVS2玻璃化保护液小滴的铝箔条上，然后将铝箔条直接浸入液氮中，待其与液氮充分接触后再装入盛满液氮的冷冻管中，拧紧盖子，投入液氮中进行保存；7)解冻洗涤：将超低温冷冻保存后的茎尖取出，投入卸载液中进行解冻和洗涤，洗涤次数为2次，每10min更换一次卸载液；其中卸载液的配方为：MS+1.2mol/L蔗糖；8)恢复再生培养：将洗涤后的茎尖转移到装有恢复再生培养基的培养皿中进行恢复培养，先在25℃培养箱中暗培养3～5d，然后转入正常光照条件下继续培养；其中恢复再生培养基的配方为：MS+0.1mg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L琼脂；所述正常光照条件：光照强度1500lux，光照时间为16h/d。